ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Фотосинтез изолированных из клеток хлоропластов из "Основы фотосинтеза" Фотосинтетический метаболизм, осуществляющийся в хлоропластах, не абсолютно автономен. На его интенсивность и направленность может оказывать влияние обмен веществ, осуществляющийся в других участках клеток. Именно поэтому представляет особый интерес изучение фотосинтеза в чистом виде — в изолированных из клеток хлоропластах. [c.132] Труднее заставить хлоропласты осуществлять всю совокупность реакций фотосинтеза, характерных для этих органоидов, находящихся внутри клеток. Хилл в 1951 году отмечал, что извлеченные из клеток хлоропласты не способны осуществлять фотосинтетическую фиксацию СО2. Лишь в самое последнее время удалось получить хлоропласты, которые по интенсивности внеклеточного фотосинтеза приближались к хлоропластам in vivo (не извлеченным из клеток). [c.133] Для того, чтобы хлоропласты могли осуществлять интенсивный фотосинтез вне клеток, требуется соблюдение нескольких обязательных условий. Во-первых, необходимо, чтобы при извлечении из клеток не происходило или было минимальным вымывание ферментов, катализирующих реакции фотосинтетического восстановления углекислого газа. Несоблюдение этого условия и было основной причиной безуспешности ранних попыток показать способность изолированных хлоропластов к фикса-ции СОз. При добавлении к ним веществ белковой природы (ферментов), осажденных из надосадочной жидкости 60%-ным ацетоном, хлоропласты начинали фиксировать углекислый газ. Показательна работа Парка и Пона (1961), в которой хлоропласты шпината, разрушенные ультразвуком, разделялись на три фракции зеленый осадок, бесцветная иадосадочная жидкость и желтый, содержащий липиды слой. Зеленый осадок начинал фиксировать С Юз с интенсивностью на два порядка величин большей, если к нему добавлялась надосадоч-ная жидкость. [c.133] Надежные доказательства возможности фиксации СО2 изолированными хлоропластами были получены приблизительно в одно и то же время (1950—1951 г.) несколькими исследователями Е. А. Бойченко в СССР, Вишняком и Очоа, Арноном, Толмачом в США. [c.133] Второе требование, предъявляемое к процедуре извлечения хлоропластов, заключается в том, чтобы их структура осталась по возможности неизменной. Это относится не только к внешней мембране, но и к другим комяонентам структуры хлоропластов, от которых зависит, в первую очередь, осуществление так называемых световых реакций фотосинтеза. [c.134] В-третьих, необходимо получить достаточно чистую фракцию хлоропластов, не загрязненных митохондриями, кусками разрушенных хлоропластов, ядрами клеток. Черновым (1967) был предложен люминесцентный метод анализа степени загрязненности хлоропластов митохондриями. В суспензию хлоропластов добавлялся раствор люминесцирующего антибиотика тетрациклина (100 тысяч единиц на 100 мл), специфически адсорбирующегося митохондриями, после чего капля суспензии просматривалась с помощью люминесцентного микроскопа. В поле зрения микроскопа видны красные хлоропласты и сидящие на них митохондрии, люминесцирующие желто-зеленым светом. [c.134] Перед извлечением хлоропластов рекомендуетоя в течение определенного времени (12—14 часов) выдержать листья в темноте или при слабом освещении, чтобы гидролизовался крахмал и исчезли крахмальные зерна,. которые содержатся в хлоропластах и разрушают их при центрифугировании. [c.135] Наивысшая интенсивность фиксации СО2 изолированными хлоропластами достигается при определенных значениях pH, которые обеспечиваются с помощью специальных буферных систем. Оказалось, что тип буферной системы влияет на интенсивность фотосинтеза. Например, по данным Гуда, трис-H i буфер оказался менее приемлемым, по сравнению с органическими буферными системами, получившими название Трисин, Хепес, Мес, Тес. Если интенсивность фотосинтеза хлоропластов в трис-НС1 буфере быстро снижалась уже через 20 минут после извлечения хлоропластов, то в органических буферных системах, указанных выше, не снижалась в течение часа и была значительно выше. [c.135] Б ранних работах величины интенсивности внеклеточного фотосинтеза были не больше нескольких мк М/мг хлорофилла час. В последних исследованиях получены значения, превышающие 200 мк М/мг хлорофилла-час и составляющие больше 80% от ассимиляционного числа листьев, из которых были извлечены хлоропласты. [c.135] Ниже приводится описание процедуры извлечения хлоропластов, сносо бных осуществлять фотосинтетическую фиксацию СО2, за основу которой принят метод Уолкера- (1964). В связи с тем, что органические буферные смеси являются редкостью, можно использовать, особенно при кратковременном фотосинтезе, фосфатный буфер. [c.135] Введение экзогенной АТФ в реакционную смесь сильно увеличивало интенсивность фиксации СО2 изолированными хлоропластами, а неорганический фосфат вызывал противоположный эффект (Чернов, 1967). [c.136] Вернуться к основной статье