ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Нанесение суспензии на пластинку из "Методическое руководство по тонкослойной хроматографии фосфолипидов" Кроме аппликатора Шталя при получении закрепленного слоя адсорбен- а можно пользоваться и другими приспособлениями, например прибором типа Шандона (прибор входит в комплект, выпускаемый заводом Дружная горка см. стр. 41). Принцип его работы заключается в том, что пластинки, лежащие на подложке подставки, прижимаются снизу к специальным полочкам на бортах подставки и при продвижении корпуса по подставке вытекающая суспензия силикагеля образует на пластинках слой одинаковой толщины. Для получения тонкого слоя в этом случае не требуются стеклянные пластинки строго одинаковой толщины. [c.18] Для получения пластинок с закрепленным слоем можно ис--пользовать готовый силикагель марок Merk (ФРГ) и G по Шталю (ФРГ), он уже имеет в своем составе гинс. Силикагель L (Чехословакия) гипса не содержит, и при получении пластинок с закрепленным слоем к нему следует добавлять 8% гипса. Силикагель Н по Шталю (ФРГ) без гипса содержит для связывания вместо гипса небольшое количество аэросила-308—специально приготовленного мелкого силикагеля, с размером частиц 3—30 МК. Указанная добавка дает более прочный слой, чем с гипсом при нанесении его с помощью аппликатора. [c.19] Пластинки с нанесенным силикагелем помещали на столик (рис. 12), установленный горизонтально с помощью уровней, и оставляли на 3 час. для высущивания. [c.20] Затем в специальном штативе (рис. 13) в вертикальном положении пластинки ставили на 20 мин. в термостат на 110° для стабилизации содержашейся в них воды. Готовые пластинки хранили в шкафу из органического стекла (или эксикаторе, содержащем силикагель для удаления влаги) с плотно пригнанными дверцами (рис. 14). [c.21] На стандартную стеклянную пластинку 20 X 20 см можно нанести одновременно пять-шесть проб вещества при разделении в одномерной системе. Для нанесения проб на равном расстоянии друг от друга пластинку с тонким слоем силикагеля размечают. [c.21] Для калибровки микрошприца использовали раствор жирной кислоты в толуоле. В качестве растворителя толуол был выбран потому, что он мало летуч (температура кипения 110°). Источником С служила стеариновая кислота с удельной активностью 3,52 мкюри[г (1 мкюри/мМ). 10 г стеариновой кислоты растворяли в 10 мл толуола. Получали раствор с активностью 3,5 мккюри мг, или 3,5 мккюри в 1 мл (35 мккюри в 10 мл). Весь микрошприц от О до 10 рассчитан на 30 мкл, т. е. на 0,03 мл, а полный оборот микрометрического винта изменяет объем микрошприца на 0,001 мл, следовательно, калибровали микрошприц в диапазоне делений от 0,001 до 0,03 мл. С помощью микрошприца наносили на диски 0,001 мл 0,1%-ного радиоактивного раствора стеариновой кислоты в толуоле, определяя каждый шаг на протяжении 30 оборотов микрошприца. Повторность опыта трехкратная. Все диски считали 1 мин. и сравнивали с интенсивностью счета раствора, добавленного в диски из пипетки, откалиброванной гравиметрически (Loury et al., 1954 Gogglins, Tan-ser, 1969). [c.23] Для этого исходный раствор, имеющий активность 3,5 мккюри в 1 мл, разводили в 100 раз (1 мл исходного раствора разводили толуолом в мерной колбе на 100 мл, откалиброванной гравиметрически). Из полученного раствора брали откалиброванной гравиметрически пипеткой 5 жл и доводили толуолом до 100 мл (в той же мерной колбе на 100 мл). Полученный раствор 2000 раз слабее исходного 0,1%-ного раствора стеариновой кислоты. 5 мл разбавленного в такой степени раствора упаривали в фарфоровой чашке и количественно переносили на диск. Повторность опыта трехкратная. Интенсивность счета проб, взятых пипеткой на 5 мл, откалиброванной гравиметрически, сравнивали с интенсивностью проб, взятых с помощью микрошприца, и пересчитывали на количество миллилитров. Таким, образом определяли линейность шага на всем протяжении набора пробы микрошприцем. Полученные результаты приведены в приложении 1. [c.24] При разделении фосфолипидов применяют различные системы растворителей как в одномерной, так и в двумерной хромато графин. Их список приведен в приложении 6. [c.28] Для предварительной характеристики образцов выделенных веществ их разделяли на тонком слое, нанесенном на предметные стекла — слайды (рис. 21), используемые в микроскопии. Тонкий слой на слайды можно нанести одним из двух способов илй стекла погружают в суспензию силикагеля, вынимают и сушат, или суспензию наливают на стекла, дают ей растечься, а затем тоже сушат. Стекла сушат на столике, установленном горизонтально по уровню, и хранят в шкафу из органического стекла. [c.28] После разделения хроматограммы вынимали из камеры и помещали в вытяжной шкаф, а затем в термостат на П0° для удаления растворителей. В дальнейшем их последовательно обрабатывали в специальной камере (рис. 23) из стеклянных опрыскивателей (рис. 24) с помощью сжатого воздуха различными проявителями. [c.29] Для получения устойчивой черной окраски, необходимой для денситометрии пятен (см. рис. 28), хроматограммы опрыскивали насыщенным раствором КаСгаО, в 80%-ной серной кислоте и выдерживали в сушильном шкафу при 180° в течение 25 мин., за это время пятна фосфолипидов обугливались. Хороший белый фон при обугливании фосфолипидов достигается при опрыскивании пластинок хромовой смесью без предварительной обработки другими реагентами. [c.29] Для идентификации фосфолипидов использовали метчики фосфатидную кислоту, фосфатидилэтаноламип, фосфатидилхо-лин, фосфатидилинозит, сфингомиелин. Метчики наносили в две точки, находящиеся на краях тонкослойной пластинки, а исследуемый раствор фосфолипидов — в точки, расположенные в середине хроматограммы. [c.29] Фосфолипиды можно идентифицировать по специфичным реакциям окрашивания. Для этого пластинку обрабатывают нин-гидрином для обнаружения фосфолипидов, содержащих аминокислоты (фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламип) наблюдали красно-фиолетовое окрашивание пятен на белом фоне. [c.30] Затем хроматограмму опрыскивали раствором Драгендорфа для обнаружения холинсодержащих фосфолипидов (лецитин. [c.30] В качестве универсальных веществ для окрашивания фосфолипидов применяли пары иода, родамин В, родамин 60, 2,7-ди-хлорфлуоресцеин и морин. После экспозиции и удаления растворителей тонкослойную хроматограмму фосфолипидов помещали на 5—10 мин. в камеру с лодочкой, смоченной раствором иода в гексане, или на дно камеры ставили стакан с металлическим иодом. Пары иода окрашивали ненасыщенные фосфолипиды в коричневый цвет на белом фоне. На хроматограмме, вынутой из камеры, через 2—3 часа пятна фосфолипидов пропадали и появлялись вновь при повторном помещении пластинки в пары иода. [c.31] Пластинки с идентифицированными пятнами фосфолипидов фотографировали способом контактной печати (см. стр. 32). Количественное содержание этих веществ измеряли или при помощи денситометра, или элюированием пятен для определения содержания в них фосфора, которое в дальнейшем пересчитыйа-лось на фосфолипиды. [c.31] Вернуться к основной статье