ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Определение молекулярной массы и степени полимеризации полисахаридов из "Химия и биохимия углеводов" Выделение и очистка высших полиоз и углеводсодержащих биополимеров представляет собой исключительно трудную задачу. В природных условиях эти соединения находятся в виде с 10жных смесей с низкомолекулярными веществами,молекулами неуглеводной природы, наконец, с другими высокополимерными углеводами. Трудности возрастают в связи с тем, что, будучи весьма лабильными веществами, полисахариды под влиянием даже слабых воздействий легко подвергаются различным изменениям часто происходят их деполимеризация, окисление и другие изменения. Факторами, вызывающими такие изменения, помимо применяемых реагентов (обычно щелочной или кислой природы) являются кислород воздуха (в связи с этим иногда выделение приходится вести в атмосфере азота), ферменты, находящиеся в клетке, часто связанные с самими полисахаридами (как, например, фосфорилаза и амилаза, связанные с гранулами крахмала). [c.52] Необходимо подчеркнуть, что наши представления о степени лабильности полисахаридов в последние 10—15 лет сильно изменились она явно недооценивалась. [c.52] Выделение полисахаридов. Методы выделения полисахаридов, естественно, прежде всего зависят от их свойств — растворимости, лабильности к различным реагентам и т. д. Растворимость полисахаридов в воде весьма различна. Растворимые в воде полисахариды можно эксграгировать водой или же кислыми или щелочными растворами, а затем осадить тем или другим способом. Если полисахариды практически нерастворимы и достаточно прочны, легче извлечь или разрушить сопровождающие их вещества. Так поступают при выделении целлюлозы и хитина, отличающихся большой химической прочностью. [c.53] В подавляющем большинстве случаев полисахариды извлекают водой при комнатной или повышенной температуре. Повышение температуры приводит к увеличению растворимости большинства полисахаридов. [c.53] Различная растворимость полисахаридов в воде иногда позволяет произвести фракционное извлечение, т. е. разделить полисахариды. Так, при извлечении крахмала теплой водой в раствор переходит амилоза, сильно разбухающий и более высокомолекулярный амилопектин переходит в раствор лишь в очень малой степени. Для кислых полисахаридов, например сульфатированных полисахаридов, целесообразно вести извлечение разбавленными минеральными кислотами, которые вытесняют их из соответствующих солей. [c.53] Многие полисахариды, как гемицеллюлозы, камеди, лучше извлекаются растворами щелочей различных концентраций. [c.53] Иногда крепкими горячими растворами щелочей пользуются для извлечения полисахаридов с одновременной подготовкой к освобождению от белков, переходящих в щелочные альбуминаты и продукты щелочного расщепления, не осаждающиеся спиртом. Так поступают, например, при классическом методе выделения (и количественного определения) гликогена по методу Пфлюгера. Конечно, такая жесткая обработка приводит к частичной деполимеризации и деградации гликогена см. с. 109). [c.53] Иногда для извлечения полисахаридов пользуются и другими растворителями, как диметилсульфоксид и др. [c.53] Извлеченные полисахариды затем осаждают. При этом полисахариды не только осаждаются, но и очищаются от низкомолекулярных примесей, в частности минеральных солей, моносахаридов и низших олигосахаридов, которые при экстрагировании переходят в раствор вместе с полисахаридами. [c.53] В качестве осадителя чаще всего пользуются этиловым спиртом. При концентрации спирта порядка 80% большинство полисахаридов выпадает в осадок, а низкомолекулярные примеси остаются в растворе. Постепенно прибавляя спирт и выделяя осадки, выпадающие при повышающихся концентрациях спирта, удается провести фракционное осаждение полисахаридов. Сравнение свойств и моносахаридного состава фракций является важным критерием для суждения о гомогенности полисахаридов. [c.53] Соли четвертичных аммониевых оснований с длинноцепочечным радикалом весьма успешно используются для разделения и фракционирования кислых и нейтральных полисахаридов. Катионы этих солей, как, например, наиболее часто применяемых цетавлона (бромида цетилтриметиламмония) и хлорида це-тилпиридиния, образуют соли с анионными группировками (сульфатными и карбоксильными) кислых полисахаридов,а длинноцепочечный радикал катионов вследствие своей гидрофобности способствует выпадению осадков. [c.54] Поскольку кислотность сульфатных и карбоксильных групп различна при помощи цетавлона или хлорида цетилпиридиния при различных pH можно фракционировать смеси кислых полисахаридов. [c.54] Баркер [1] применил цетавлон и для разделения нейтральных полисахаридов. В боратном буфере полисахариды дают полисахаридборат-ные комплексы. Образующиеся кислые группировки реагируют с катионом цетавлона. Поскольку разные полисахариды реагируют с борной кислотой с различной легкостью, Баркеру удалось, например, отделить при помощи цетавлона дрожжевой маннан от гликогена. [c.54] В последующие годы мы [2, 3] синтезировали свыше 20 солей четвертичных оснований (СЧО) с различными радикалами и испытали возможность их применения для разделения нейтральных полисахаридов. Оказалось, что из этих солей особенную ценность представляет ДМДБАХ — диметилдодецилбензиламмонийхлорид. Обладая высокой осаждающей способностью, он имеет перед цетавлоном то преимущество, что легче растворяется в спирте, а потому легче вымывается из осадка полисахарида. Более подробно проблема фракционирования нейтральных полисахаридов при помощи СЧО и некоторые найденные при этом закономерности будут рассмотрены в главе о фракционировании а-глюканов, поскольку она разрабатывалась главным образом на них (см. с. 128). [c.54] Полисахариды также образуют медные комплексы при осаждении раствором Фелинга. При наличии в моносахаридных остатках полисахарида двух 1 ис-гидроксилов ион меди замещает атомы водорода этих гидроксилов, образуя нерастворимое в воде соединение. Этот способ очень удобен для выделения маннанов и глю-команнанов, обладающих г с-гидроксилами у С-2 и С-3 маннозных остатков. Разложение медных комплексов полисахаридов производят уксусной кислотой, после чего полисахариды осаждают спиртом. [c.54] Необходимо, однако, подчеркнуть, что применение фелингова раствора, содержащего крепкую щелочь, и уксусной кислоты в процессе регенерации полисахарида может привести к частичной деградации и деполимеризации исходного полисахарида. Так, например, щелочная обработка способствует гидролизу сложноэфирной связи непрочных ацетильных групп (см. с. 158). [c.54] Амилоза крахмала легко дает комплексы с н-бутанолом и некоторыми другими соединениями — спиртами, фенолами, нитропроизводными и другими веществами (см. с. 127). [c.55] Осаждение при помощи лектииов привлекает в последние годы большое внимание. Лектины — вещества белковой природы, образующиеся в растениях и специфически реагирующие с концевыми группами полисахаридов. Это взаимодействие аналогично реакции антиген-антитело в иммунохимии (о лектинах см. с. 97). [c.55] Иммунохимические методы, в частности осаждение антисыворотками, являются наиболее специфическими (см. с. 102). [c.55] Очистка полисахаридов. Выделенные полисахариды уже частично освобождены от примесей. Дальнейшая более тщательная очистка от низкомолекулярных примесей проводится путем диализа или электродиализа (при котором ионы под влиянием электрического поля удаляются быстрее), а также ультрафильтрованием (через полупроницаемые мембраны с определенными размерами пор), при котором удаляются примеси и полисахариды делятся на фракции с определенными границами молекулярных масс. [c.55] Вернуться к основной статье