ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Применение поляризационных измерений из "Фото-люминесценция растворов" Таким образом, если поляризация и вязкость раствора измерены в интервале температур, в котором изменения т малы (как это имеет место для многих веществ с высокой эффективностью флуоресценции прп комнатной температуре, см. раздел II, Б, 5), то график зависимости lip от Т/г будет представлять собой прямую линию с наклоном (1/ро + Уз) т/У и отсечением 1/Ро. Следовательно, из этих данных можно определить как ро (при этом не обязательно проводить измерения при очень низких температурах), так и молярный объем V. Если т сильно зависит от температуры (например, в случае Г] 5о-фосфоресцепции в жидких средах), то для получения прямой линии по оси абсцисс нужно откладывать величину тГ/т]. Больщинство молекул не являются строго сферическими, но обычно и для них график зависимости 1/р от Т/г представляет собой достаточно хорощую прямую, из которой можно найти эффективный молярный объем V [308]. [c.372] Диапазон температур и вязкостей, в котором происходят заметные изменения поляризации, определяется отношением RTxIVx]. При больших временах жизни, при высоких температурах и в растворителях с низкой вязкостью испускание будет почти полностью деполяризовано, а р будет слишком мало для того, чтобы его можно было измерить. При малых т и Г в сильно вязких растворителях р будет практически постоянным и равным ро. Поэтому полезно выяснить, какими могут быть значения р при разных условиях и какие значения четырех параметров (Т, t, V, т)) дают поляризации, заметно отличающиеся от ро и от нуля. В табл. 43 приведены некоторые данные для типичной малой флуоресцирующей молекулы, имеющей молярный объем порядка 500 см (флуоресцеин), и для большой полимерной молекулы с V = 5-10 см (белок). Времена жизни соответствуют флуоресценции (10 с) и фосфоресценции (Ю с). [c.372] Принято, что 3 = 0 и используется неполяризованный возбуждающий свет, т. е. 1/Р- 3 +(3,333 / Гт/Кт1). [c.373] Метод применялся главным образом для определения размеров больших молекул, например белков. Обычная процедура состоит в обработке белка флуоресцирующим реагентом, необратимая реакция с которым дает флуоресцирующую полимерную молекулу. Нужные реагенты чаще всего получают, вводя изоцианатные, изотиоцианатные или сульфохлоридные группы в обычные флуоресцирующие соединения. Хорошо взаимодействуют с белком, например, изоцианаты флуоресцеина, родамина Б и антрацена. Флуоресцирующие изоцианаты необратимо реагируют со свободными амино- или сульфгидрильными группами белка. Очевидно, что и реагенты и условия реакции следует подбирать так, чтобы размер и физическое строение молекулы белка изменялись в минимальной степени. Обычно времена жизни полученных этим способом флуоресцирующих конъюгатов белков близки к временам жизни простых флуоресцирующих молекул. Подробные данные о методике и ее применении можно найти в обзоре [308]. [c.373] Деполяризация флуоресценции малой молекулы, обладающей в жидком растворе коротким временем вращательной релаксации, сильно снплсается, если эту молекулу связать с большой молекулой полимера. Поэтому измерения поляризации можно использовать для определения доли связанных молекул и, следовательно, константы равновесия этого обратимого процесса. Таким способом Велик [310] измерил константы равновесия комплексов коферментов, а Лоуренс [311] изучил равновесие между красителями и белками и их комплексами. [c.374] Тушение флуоресценции при столкновениях приводит к уменьшению выхода флуоресценции, которое следует закону Штерна — Фольмера [уравнение (73)]. Однако точно такая же зависимость получается и в тех случаях, когда тушитель образует с флуоресцентной молекулой нефлуоресцирующий комплекс, но сам по себе не тушит возбужденное состояние не связанной в комплекс молекулы (см. раздел II, Б, 2). Измеряя время жизни испускания, можно сделать выбор между двумя упомянутыми механизмами тушения. В случае тушения при столкновениях время жизни снижается пропорционально интенсивности флуоресценции, а в случае образования комплексов опо не изменяется. Измерения поляризации флуоресценции являются простым косвенным методом определения времени жизни и поэтому позволяют выяснить, какой из двух механизмов тушения имеет место [312]. [c.374] НО резко изменяется в области перекрывания двух полос поглощения, соответствующих переходам с разными значениями р. Примером простого поляризационного спектра может служить спектр крезола, полученный Вебером [215]. Он обнаружил, что в, полосе поглощения при 275 нм поляризация достигает максимального значения около 0,22, а в области полосы 235 нм падает до —0,065. Использовав уравнение Яблонского [уравнение (54), возбуждение естественным светом], Вебер получил для переходов при 275 и 235 нм значения соз р, равные 0,185 и 0,78 (их сумма приблизительно равна единице), и пришел к выводу,, что переходные моменты направлены под прямым углом друг к другу. [c.375] Ширина полосы возбуждения 3 нм, ширина полосы испускания 33 нм. [c.375] Но возможны применения и более тонких поляризационных эффектов. Так, Вебер [314] обнаружил, что белки, содержащие фенилаланиновые и тпрозиновые остатки, но не содержащие триптофановых остатков (т. е. белки, имеющие спектр испускания флуоресценции, характерный для тирозина), дают поляризационный спектр, подобный спектру тирозина или крезола, однако значения предельной поляризации будут ниже, чем у простых молекул. Вебер пришел к выводу, что в пределах одной и той же белковой молекулы происходит перенос энергии между тиро-зиновыми остатками. [c.376] Вернуться к основной статье