ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Факторы, определяющие выбор геометрического расположения образца из "Фото-люминесценция растворов" Геометрическое расположение пучка возбуждающего света и выбор направления наблюдения флуоресценции по отношению к образцу остаются одними из наиболее спорных пунктов при изготовлении спектрофлуориметров. Отчасти это обусловлено разными назначениями приборов в каждом конкретном случае, отчасти — различной чувствительностью используемых приборов, а также и тем, что многие путают понятия тушения и эффекта внутреннего фильтра. [c.210] В этих процессах поглощаемая люминесцирующей молекулой энергия расходуется безызлучательным путем. Это внутренняя конверсия, интеркомбинационная конверсия, перенос энергии, а также дезактивация, вызываемая столкновениями с другими молекулами растворенного вещества. Тушение люминесценции, таким образом, является фундаментальным явлением, характерным для системы при определенных условиях, и не зависит от способа проведения эксперимента, в котором оно исследуется. Напротив, эффекты внутреннего фильтра представляют собой методический артефакт. Они не влияют на первичные процессы испускания света возбуледенными молекулами, но уменьшают наблюдаемую интенсивность люминесценции за счет поглощения либо возбуждающего света, либо люминесценции внутри исследуемого образца. Паркер и Рис [150] рассмотрели два типа эффектов внутреннего фильтра а) дополнительное поглощение возбуждающего света и б) поглощение испускаемой люминесценции. Мы обсудим их при рассмотрении трех основных типов расположения образца, показанных на рис. 78. [c.211] Раствор бисульфата хинина в 0,1 н. серной кислоте при 20° С в кювете толщиной 1 см. [c.212] А— 1 мкг/мл — 10 мкг/мл (при пониженной чувствительности) В — 100 мкг/мл (дальнейшее снижение чувствительности). Кривые А, Б и В —освещение под прямым углом. Кривая Г—10 мкг/мл при фронтальном освещении и оптической толщине 1о мм. [c.212] В сильно концентрированных растворах наблюдается искажение наблюдаемого спектра возбуждения флуоресценции. Так, на рис. 79 при увеличении концентрации бисульфата хинина с 1 до 10 мкг на 1 мл (кривые А и Б) высота основного максимума возбуждения (соответствующего максимальному поглощению) уменьшается относительно слабого максимума с меньшим волновым числом. [c.213] При более высоких концентрациях (кривая В) поглощение возбуждающего света в основном максимуме возбуждения становится таким большим, что значительная часть флуоресценции не регистрируется фотоумножителем, если для возбуждения используется свет с волновым числом максимума и наблюдаемый спектр возбуждения имеет минимум в этой точке. Остальная часть спектра такл е искажается. [c.213] Влияние второго поглощаю-щего вещества на спектр возбуждения [150]. [c.213] Спектры возбуждения (при освещении под прямым углом в кювете толщиной 1 см) антрацена в этаноле 0,1 мкг/мл) в присутствии бензола А — 0%, В — 0,05 Ь,- В и — 0,125%, Г — 0,25%, Л — 0,5 0 бензола. Для кривых А—Д анализирующий монохроматор установлен иа люминесценцию антрацена (2,5 мкм 0 для кривой Е он установлен на флуоресценцию бензола (з,6 мкм ). [c.213] Возбужден )е при 2,73 мкм (366 нм). Оптическая толщина для света флуоресценции 2,5 см. Ширина полосы анализирующего кварцевого монохроматора 0,01 мкм при 2,0 мкм . Л —раствор 80 мкг/мл бисульфата хинина в 0,1 н. серной кислоте при 20° С 5 —то же, что и кривая А, плюс 0,12 ТН раствор хлорида неодима и повышенная чувствительность для компенсации тушения В — спектральная чувствительность анализируюш.ей системы (фотоумножитель типа 9558). [c.214] Присутствие второго поглощающего вещества не влияет на поглощение до тех пор, пока общая доля поглощаемого возбуждающего света мала, т. е. аналогично освещению под прямым углом. При полном поглощении каждое растворенное вещество будет поглощать некоторую долю возбуждающего света, пропорциональную его значению О, и если значение О для второго растворенного вещества существенно больше (а перенос энергии не имеет места), то флуоресценция первого растворенного вещества будет полностью погашена но не потушена). Простым примером этого является измерение спектра возбуждения в растворителе, таком, как четыреххлористый углерод, который полностью срезает половину ультрафиолетовой области. В коротковолновой области спектр возбуждения падает до нуля. [c.216] А — 100 мкг/мл 1 фенил-2-нафтила-мина в бензоле с возбуждением при 2,73 или при 3,Ш мкм Б —то же, что и кривая А, но в присутствии 40 мкг/мл нафтацена (возбуждение прп 2,73 мкм М В —то же. что и кривая Б, ио с большим поглощением возбуждающего света (з,19 мкм 0-I и 2— соответственно поглощение и и флуоресценция нафтацена. Ширина полосы кварцевого анализирующего монохроматора 0,1 мкм прп 2,0 мкм . [c.216] Метод освещения в линию г на рис. 78) дает для разбавленных растворов неискаженные спектры возбуждения и испускания, и сигнал пропорционален концентрации флуоресцирующего вещества. В этом отношении этот метод похол на фронтальный метод и метод освещения под прямым углом. Применение этого метода для измерения очень слабой флуоресценции имеет два серьезных недостатка. Первый состоит в том, что непоглощенный возбуждающий свет непосредственно поступает в анализирующий монохроматор, и если используется одинарный монохроматор, то некоторое количество света, рассеиваемое в монохроматоре, будет проходить через выходную щель при всех длинах волн, и слабое испускание раствора может быть замаскировано этим фоновым испусканием. Этот недостаток может быть устранен использованием двойного монохроматора для анализа флуоресценции или использованием фильтра, расположенного между образцом и анализирующим монохроматором, который поглощает возбуждающий свет, но пропускает флуоресценцию. Этот фильтр должен иметь очень слабую собственную флуоресценцию. Вторым недостатком является наложение нежелательных длин волн возбуждающего света. Оно может вызываться рассеянием света внутри монохроматора возбуждения (если это одинарный монохроматор) или фильтрами, которые используются для выделения нужной длины волны возбуждающего света. Нежелательные длины волн возбуждающего света в области полосы флуоресценции будут проходить прямо через второй монохроматор и вызывать очень большой фон. Вопросы, связанные с флуоресценцией фона, подробно обсуждаются в гл. V. [c.218] При измерении сильно флуоресцирующих растворов наложение рассеянного света при освещении в линию менее значительно, и следует кратко обсудить преимущества такого расположения и эффекты внутреннего фильтра при использовании этого метода. Что касается искажений в спектре возбуждения, то эффекты здесь те же, что и при фронтальном освещении, т. е. [c.218] Искажение спектра флуоресценции в результате самопоглощения или поглощения флуоресценции вторым веществом при расположении в линию больше, чем, при фронтальном освещении или освещении под прямым углом, так как в сильнопоглощающем растворе весь свет флуоресценции должен пройти весь слой жидкости до того, как попасть в регистрирующий прибор. Тем не менее расположение в линию имеет преимущество перед фронтальным расположением, так как его легче осуществить и наблюдаемая интенсивность не так сильно зависит от точного положения кюветы, содержащей образец. По этой причине такой метод используется для исследования влияния больших концентраций на флуоресценцию растворенного вещества. При выполнении таких измерений не следует игнорировать тот факт, что часть спектра подвержена самопо-глощению. Например, на рис. [c.219] НИИ ртутной лампы, выделенной двойным кварцевым монохроматором. Спектры анализировали с помощью второго двойного монохроматора, поэтому наложением возбуждающего света, рассеянного анализирующим монохроматором, можно было пренебречь. Однако один источник помех показан кривой 6, он является сигналом от кюветы с чистым этанолом. Это испускание дает линза из плавленого кварца, используемая для фокусировки флуоресценции на входную щель анализирующего монохроматора. От этой флуоресценции избавлялись заменой линзы из плавленого кварца на линзу из синтетической двуокиси кремния или устраняли облучение линзы с помощью кюветы из синтетической двуокиси кремния с бензолом, помещенной между образцом и фокусирующей линзой анализирующего монохроматора. Остальные кривые иллюстрируют три эффекта самопоглощение флуоресценции, влияние сильного поглощения возбуждающего света и концентрационное тушение. В разбавленных растворах антрацена (кривые 1 и 2) самопоглощение флуоресценции ничтожно, и были получены практически неискаженные спектры. При увеличении концентрации первая (коротковолновая) полоса флуоресценции сильно поглощалась из-за перекрывания с полосой поглощения и практически полностью отсутствовала в более концентрированном растворе (кривая 5). Напротив, поглощение при 400 нм было пренебрежимо мало во всех растворах, и интенсивность основной колебательной полосы при этой длине волны, таким образом, являлась мерой скорости испускания флуоресценции растворов. Поглощение было полным при концентрации 3,4 10 Л4, и интенсивности флуоресценции при 400 нм в этом растворе и в растворе концентрации 3,4-10 М были одинаковыми (кривые 3 ц 4). Интенсивность флуоресценции уменьшалась в растворе концентрации 3,4-10 М из-за концентрационного тушения (см. раздел. II, Б, 2). [c.220] Другим преимуществом расположения в линию является то, что оно позволяет сравнивать интенсивность флуоресценции (или замедленного испускания) растворов, содержащихся в разных цилиндрических кюветах, ири условии, что оптическая толщина кювет одинакова. Наблюдения при освещении таких кювет под прямым углом могут привести к ошибкам, так как люминесценция наблюдается через искривленную поверхность, а геометрия последней обычно неодинакова для разных кювет. Это несущественно при освещении в линию, где используются только два плоских окошка кюветы. Цилиндрические кюветы удобны в тех случаях, когда перед измерением нужно вакууми-ровать раствор (см. раздел III, И, 2), так как они выдерживают замораживание лучше, чем прямоугольные кюветы. Применение освещения в линию при определении квантового выхода образования триплетов описано в гл. IV. [c.220] При использовании линейного расположения очень важно избегать сканирования монохроматора флуоресценции через весь интервал возбуждающего света. Если это все-таки случится при слабо поглощающем растворе, на фотоумножитель попадет интенсивный пучок света, что может вывести его из строя. Для предотвращения этого можно использовать защитный фильтр, например бензол (см. рис. 84). [c.221] Идеальным спектрофлуориметром является прибор со сменным держателем кювет, который позволял бы использовать любое расположение фронтальное, в линию или под прямым углом. Желательно, чтобы монохроматор возбуждения, лампа и т. д. составляли один блок установки, а анализирующий монохроматор и фотоумножитель — другой, так, чтобы можно было легко изменить их взаимное расположение в зависимости от конкретных требований. [c.222] Вернуться к основной статье