ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Исследование первичной структуры полинуклеотидов из "Органическая химия нуклеиновых кислот" Единственный подход, который позволил в настоящее время установить полную структуру ряда РНК, — так называемый блочный метод — основан на реконструкции структуры полинуклеотида на основании данных о структуре фрагментов, полученных при его частичном расщеплении. При этом проводят расщепление, по крайней мере, двумя разными методами, различающимися по своей специфичности. Обычно для РНК применяют гидролиз пири-мндил- и гуанил-РНК-азамн. После разделения полученных коротких олигонуклеотидных фрагментов (обзоры — см. их строение устанавливают с помощью рассмотренных ниже методов. [c.73] Известная специфичность ферментов позволяет воссоздать некоторые частичные последовательности полинуклеотидной цепи. Далее проводят расщепление исходного полинуклеотида на более крупные блоки (чаще всего для этой цели применяют частичный гидролиз гуанил-РНК-азой) и отыскивают в них участки нуклеотидных последовательностей, позволяющие однозначно расставить в полинуклеотидной цепи фрагменты, полученные ранее, и воссоздать таким образом полную структуру полинуклеотида. Существенным моментом для успеха такой реконструкции является присутствие в нуклеотидной последовательности уникальных участков, которые могут быть использованы как отправные точки. Для этой цели можно использовать концевые группы, а также редкие компоненты или олигонуклеотиды, встречающиеся в продуктах ферментативного гидролиза полинуклеотида только один раз. [c.73] В продуктах гидролиза 5 -фрагмента (б) аланиновой тРНК под действием пиримидил-РНК-азы обнаружен уникальный динуклеотид IpGp (В8) это однозначно показывает структуру З -концевого участка изучаемого фрагмента. Близость редкого компонента к концу цепи изучаемого фрагмента позволяет однозначно решить, что два динуклеотида pGp (фрагменты Б7 и Б8) должны находиться на участке последовательности 11—14 поскольку структуры обоих динуклеотидов одинаковы, последовательность всего фрагмента (1—36) устанавливается однозначно. [c.77] Второй метод состоит в частичном метилировании полинуклеотида диметилсульфатом и последующей обработке гуанил-РНК-азой. Фосфодиэфирные связи остатков гуанозина, подвергшихся метилированию по N-7, не расщепляются. [c.78] Аналогично была проведена реконструкция фрагментов 2, 3, 4 и 5 [см. часть (б) схемы 2] в качестве исходных точек использовались З -концевой остаток РНК и уникальные декануклеотиды, найденные в продуктах полного гидролиза полимера под действием гуанил-РНК-азы (последовательности 24—33 и 87—96). [c.79] Значительные трудности представляла окончательная реконструкция структуры молекулы, так как на З -конце фрагментов 1—4 и на 5 -конце фрагментов 2—5 имеется одинаковая последовательность GpUpApGp. Положение фрагментов 1 и 5 однозначно определяется концевыми группами наконец, из продуктов частичного гидролиза 5S РНК гуанил-РНК-азой удалось выделить олигонуклеотиды, позволившие связать фрагменты 2, 3 и 4. [c.79] Другие компоненты рибосомальной РНК. Молекулярный вес компонентов рибосомальной РНК 23S и 16S значительно выше, чем 5S РНК, и задача полного установления полинуклеотидной последовательности в таких полимерах остается пока нерешенной. [c.79] Схема 2. Установление первичной структуры 5S РНК из Es he ri hia oli. Al —продукт частичного гидролиза гуанил-РНК азой Б1, Б2—продукты частичного гидролиза пиримидил-РНК-азой В1 — продукт частичного гидролиза кислой РНК-азой селезенки П, Г2 —продукты гидролиза гуанил-РНК-азой после предварительного метилирования Д1 —продукт гидролиза пири-мидил-РНК азой после обработки карбодиимидом Е1, Е2 —продукты полного гидролиза гуанил-РНК-азой Ж1. Ж2 —продукты полного гидролиза пиримидил-РНК-азой. [c.80] РНК вирусов. В случае вирусных РНК успехи, достигнутые при изучении структуры, еще более ограничены. [c.81] При гидролизе РНК вируса табачной мозаики действием гуанил-РНК-азы удалось выделить три длинных олигонуклеотида уникальной последовательности для локализации их положения в молекуле РНК использован прием частичной депротеинизации РНК фага. Известно, что депротеинизация фаговой РНК под действием додецилсульфата происходит последовательно, начиная с 5 -конца цепи PHK s. Прерывая процесс депротеинизации в разные моменты времени и расщепляя освободившуюся РНК, можно определить относительное расположение различных фрагментов. [c.81] Из продуктов частичного гидролиза РНК фага К17 под действием гуанил-РНК-азы Т1 выделен ряд длинных олигонуклеотидов, для одного из которых удалось установить последовательность 520. Он содержит 57 мононуклеотидных остатков его нуклеотидная последовательность соответствует последовательности аминокислот 81—99 в белке оболочки фага. [c.82] Установление полной последовательности оснований в природных ДНК представляется делом довольно отдаленного будущего. Это связано помимо чрезвычайно большого молекулярного веса ДНК с отсутствием специфических методов расщепления, которые позволяли бы получать олигонуклеотидные фрагменты достаточно большой длины и однозначно устанавливать их последовательность. [c.82] КОГО подхода зависит от успешного разрешения двух проблем. С одной стороны, существенное значение имеет усовершенствование техники электронной микроскопии и методики приготовления образцов. С другой стороны, необходима разработка методов химической модификации ДНК, позволяющих избирательно пометить различные виды оснований. Важно, чтобы вводимая метка была достаточно хорошо видна при электронной микроскопии, т. е. модифицирующий агент должен содержать атомы тяжелых металлов (например, свинца, ртути, меди, урана). или функциональные группы, способные образовывать устойчивые комплексы с катионами этих металлов. Некоторые реагенты, по крайней мере частично удовлетворяющие поставленным требованиям, уже созданы они будут упомянуты ниже. Практическая проверка этого интересного подхода к установлению последовательности нуклеотидов в полинуклеотидных цепях, однако, пока еще не осуществлена. [c.83] Вернуться к основной статье