ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Химические методы определения нуклеиновых кислот из "Биохимия нуклеиновых кислот" Подробное описание методов определения нуклеиновых кислот в тканях не входит в задачи настоящей книги. Такого рода описания читатель может найти в оригинальных работах или в последних обзорах [1, 2, 46—48], в частности в ценном обстоятельном обзоре Хэтчисона и Манро [13]. Здесь же будут изложены лишь основные принципы методов. [c.99] Приступая к рассмотрению методов определения нуклеиновых кислот, важно ясно представлять себе, что термины РНК и ДНК относятся к двум классам полинуклеотидов, а не к двум отдельным химическим соединениям с известным и неизменным составом. Мы знаем, что относительное содержание оснований изменяется в широких пределах не только у нуклеиновых кислот из различных источников, но даже у нуклеиновых кислот одного и того же происхождения при различном метаболическом состоянии. Существует хорошее общее правило—после того как метод определения нуклеиновой кислоты в какой-то ткани выбран., проверить его пригодность для данного конкретного случая. [c.99] Все химические методы определения нуклеиновых кислот основаны на определении а) фосфора, б) реакционноспособных пентозы или дезоксипентозы или их общего содержания в) пуринов и ниримидинов. Поэтому точность этих методов ограничена существующими различиями в процентном содержании фосфора, пентоз и т. н, в нуклеиновых кислотах из разных источников,. [c.99] Модификация метода Шнейдера включает использование хлорной кислоты вместо трихлоруксусной [34, 35]. [c.100] Преимущество метода Шнейдера в его быстроте и простоте. Основным недостатком метода является то, что при работе этим методом ДНК и РНК не разделяются и поэтому их можно определить только при помощи специфических цветных реакций (на пентозу и дезоксипентозу), чрезвычайно чувствительных к различным факторам. [c.100] Описаны модификации метода Шнейдера, позволяющие определять нуклеиновые кислоты в малых количествах ткани — порядка нескольких миллиграммов или даже микрограммов [39]. [c.101] По методу, предложенному Шмидтом и Таннгаузером [18], полученный после экстрагирования ткани остаток, содержащий кислотонерастворимый нелипидный фосфор, выдерживают в течение ночи в теплом разбавленном растворе щелочи. Под действием щелочи РНК расщепляется с образованием кислоторастворимых нуклеотидов, тогда как ДНК не претерпевает изменений. На этом этапе происходит отщепление неорганического фосфата от части фосфопротеидов. Затем щелочной раствор подкисляют, что приводит к выпадению в осадок ДНК и больших количеств претерпевшего деградацию белка (фракция II на фиг. 43). Содержание ДНК в осадке определяют по количеству фосфора ДНК. Кислоторастворимая надосадочная жидкость (фракция I) содержит нуклеотиды, образовавшиеся в результате распада РНК. Содержание последней определяют по количеству фосфора РНК. Фосфор фосфопротеидов (если таковые имеются) определяют путем осаждения неорганического фосфата из кислой надосадочной жидкости. Разность между содержанием неорганического фосфора и содержанием общего фосфора в этой кислой жидкости соответствует содержанию фосфора ] НК. Однако, ввиду того что содержание фосфора фосфопротеидов почти во всех животных тканях составляет всего 1—3 мг на 100 г сырой ткани, большинство авторов прежних работ им вообще пренебрегало. [c.101] По методу Огура и Розен [38], предназначенному первоначально для работы с растительными тканями, прежде всего удаляют кислоторастворимые вещества и липиды. Затем выделяют РНК, обрабатывая остаток ткани 1 н. хлорной кислотой в течение 18 час нри 4°. Для выделения ДНК полученный остаток обрабатывают 0,5 н. хлорной кислотой при 70° в течение 20 мин. При работе с животными тканями нагревание рекомендуется проводить до 80° в течение 30 мин в присутствии 1 н. хлорной кислоты. Содержание нуклеиновой кислоты в каждом из экстрактов определяют затем по содержанию фосфора, пентозы (или дезоксипентозы) или пуринов и ниримидинов. Недостаток этого метода заключается в том, что некоторое количество ДНК может экстрагироваться холодной хлорной кислотой и переходить во фракцию РНК [35]. [c.102] Кроме того, в качестве стандарта можно использовать чистые препараты рибозы или дезоксирибозы, а также очищенные образцы пуринрибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. [c.103] Пиримидиновые нуклеозиды и нуклеотиды удобно восстанавливать амальгамой натрия это дает возможность устанавливать их количество при помощи обычного колориметрического определения содержащейся в них рибозы или дезоксирибозы. [c.103] Однако наиболее чувствительным и наиболее широко применяемым методом определения пентоз [6] является орциновый метод, часто используемый для определения РНК. Соответствующие модификации метода подробно описаны Шнейдером [46] и Чериотти [36]. [c.103] Эти методы позволяют учитывать содержание только той пентозы РНК, которая связана с пуринами. Их надежность ограничена поэтому изменениями соотношения между пуринами и пирими-динами в РНК из различных источников. Был разработан метод [8], дающий возмон ность определять всю связанную с основаниями пентозу, однако этот метод не нашел широкого применения. [c.103] Значительное повышение чувствительности метода и значительное уменьшение его отзывчивости на присутствие других соединений достигаются добавлением ацетальдегида и осуществлением реакции в течение нескольких часов при 30° (вместо нескольких минут при 100°) [И]. [c.104] Чериотти [12] описал удобную и более чувствительную цветную реакцию с индолом, которая была использована и другими авторами [13, 14]. [c.104] Вернуться к основной статье