ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Хроматография и поглощение ультрафиолетовых лучей из "Биохимия нуклеиновых кислот" КИСЛОТЫ. К сожалению, соответствующий гидролиз ДНК до нуклеотидов может быть осуществлен только ферментативно (гл. V). [c.30] При помощи этих методов можно установить положение пятен и определить, как далеко то или иное соединение отошло от места нанесения гидролизата. Частное от деления этого расстояния на путь, пройденный растворителем от места старта, дает величину Rf для данного вещества в данном растворителе. [c.30] Метод хроматографии на бумаге можно использовать и для количественных определений. [c.31] После того как установлено расположение пятен, бумагу разрезают на куски, каждый из которых соответствует определенному пятну. Из этих кусков бумаги основание или нуклеотид элюируют кислотой. Коли- д-чество каждого основания можно определить по оптической плотности кислого экстракта в соответствующей области (О ультрафиолетовой части спектра, если известны молярные коэффипиенты экстинкции. Измерения производят при помощи подходящего спектрофотометра. Таким путем определяют от 5 до 40 мкг адсорбированных на бумаге веществ. [c.31] Точно измеренное количество гидролизата наносят на один конец длинной полоски фильтровальной бумаги. Бумагу увлажняют цитратным буфером с pH 3,5 и подвешивают на стеклянной палочке таким образом, что концы оказываются погруженными в чашки с буферным раствором, в которые помещают электроды. Во время ионофореза бумагу охлаждают в бане с четыреххлористым углеродом [13]. После ионофореза бумагу высушивают и положение пятен устанавливают таким же образом, как описано выше для хроматограмм. Пример разделения, осуществленного этим методом, приведен на фиг. 3. Метод ионофореза был усовершенствован Эдстрёмом [14, 52, 58] настолько, что теперь стало возможным разделять на волокнах целлюлозы нуклеотиды, полученные из нуклеиновых кислот одной клетки. [c.32] Хроматография на бумаге и ионофорез на бумаге очень удобны для разделения небольших количеств исследуемого материала. Для разделения больших количеств оснований, нуклеозидов и нуклеотидов в настоящее время широко используется хроматография на колонках из ионообменных смол. Впервые эти методы были предложены Коном и его сотрудниками [6, 7], которые пользовались колонками из катионообменной смолы дауэкс-50 и анионообменной смолы дауэкс-1 и дауэкс-2. Смесь нуклеотидов поглощается колонкой, через которую затем пропускают элюирующий раствор, содержащий конкурентный ион. Элюат собирают небольшими фракциями и в каждой из них определяют концентрацию основания или нуклеотида, используя для измерения оптической плотности ультрафиолетовый спектрофотометр. [c.32] Хроматография на колонке пригодна для разделения не только различных оснований или их производных, но и для разделения чрезвычайно близких по строению производных, например 2 -, 3 - и 5 -фосфатов одного и того же нуклеозида. [c.32] ДЛЯ работы с неболыпими кол15чествами исследуемого материала (1 мкг или менее) [51, 55] для разделения дезоксирибонуклеотидов и дезоксирибонуклеозидов [57] обычно используют целлюлозу [57]. Основания нуклеиновых кислот очень быстро и удобно разделять нри помощи хроматографии в тонком слое целлюлозы [56]. [c.34] К методам, близким к хроматографии на колонках, относятся зонный электрофорез [20], электрофорез на крахмальном геле [40] и метод противоточного распределения [21, 33, 50]. [c.34] ЭКСТИНКЦИИ нуклеиновых кислот примерно в 30—60 раз больше коэффициента экстинкции белков. Это свойство было использовано для фотографии в ультрафиолете и измерения поглощения в ультрафиолете (гл. VI). [c.36] Следует отметить, что коэффициент экстинкции нуклеиновой кислоты значительно возрастает при распаде или гидролизе. [c.36] Видны максимум поглощения при 260 лшк и минимум при 230 ммк. Для данного образца РНК значения 6 Р) при этих двух длинах волн составляют 8710 и 4212 соответственно. [c.36] Вернуться к основной статье