ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Проблемы ферментативной кинетики из "Кинетика ферментативного катализа" Практически все химические реакции в живых организмах — каталитические. Биологический смысл этого вполне очевиден. Специфика внутренней среды живых организмов, где осуще ствляются многочисленные биохимические процессы, состоит в том что она содержит весьма лабильные вещества, не допускающие при сутствия сильных в химическом смысле реагентов (сильных кислот оснований, окислителей, восстановителей и т. п.). В живых орга низмах невозможны жесткие условия для химических реакций Все реакции протекают при практически постоянной температуре постоянном давлении, относительно невысоких концентрациях реагирующих веществ в нейтральной или близкой к нейтральной среде. [c.5] Вместе с тем энергетические и материальные потребности организмов весьма велики и покрываются за счет пищи, состоящей из сравнительно устойчивых в химическом отношении веществ, а также вдыхаемого с воздухом кислорода. Таким образом, в ходе возникновения и эволюции живых существ вырабатывались такие механизмы, которые обеспечивали высокую скорость осуществления биохимических процессов в относительно мягких условиях. В ходе эволюции эта задача была решена путем создания биологических катализаторов — ферментов, способных высоко эффективно и специфично ускорять многочисленные и разнообразные по химическому механизму реакции, необходимые для сохранения и воспроизведения живого. Механизм этот возник, по-видимому, на самых ранних этапах эволюции живой материи. Во всяком случае фактически на всех известных нам уровнях эволюционного развития (от простейших форм живых организмов до высших, как в мире животных, так и в мире растений) без ферментативных процессов жизни не существует. [c.5] Проблема механизма ферментативного катализа имеет большое значение для развития химии и химической технологии. Как известно, каталитическое действие ферментов количественно в значительной степени превосходит соответствующий эффект небиологических катализаторов. Помимо того, ферменты, в отличие от небиологических катализаторов, обладают высокой специфичностью действия, т. е. способностью катализировать реакции строго определенных партнеров и в строго определенном направлении, что исключает различные побочные реакции. Как уже говорилось ранее, ферменты в отличие от многих небиологических катализаторов оказывают каталитическое действие в мягких условиях (водные растворы, низкая температура, нейтральная среда и т. п.), что предотвращает возможность разложения неустойчивых веществ и — самое главное — позволяет осуществлять часто очень сложные химические процессы со значительно меньшими энергетическими затратами. [c.6] Все эти особенности биокатализаторов ставят перед наукой задачу создания на основе данных о строении и механизме действия ферментов таких катализаторов промышленного значения, которые обладали бы свойствами ферментов и, возможно, превосходили бы их. Создание таких катализаторов позволит организовать высоко экономичные процессы химической переработки различных материалов. [c.6] В настоящее время нет сомнений в том, что ферментативный катализ в принципе во многом подобен обычному, небиологическому катализу. Как в том, так и в другом случае молекулы реагирующих веществ вступают во взаимодействие с катализатором, образуя более реакционноспособные промежуточные соединения, которые после образования конечных продуктов реакции освобождают катализатор для последующих повторяющихся реакционных актов. Таким образом, при исследовании механизма ферментативного катализа, как и катализа вообще, главными проблемами являются химическое строение каталитически активных центров ферментов, химическое строение промежуточных продуктов реакции, механизм их образования и распада, причины высокой реакционной способности промежуточных соединений. [c.6] Ферменты являются обычно белками глобулярной структуры, характеризующимися не только специфичной последовательностью аминокислоте полипептиднойцепи (первичная структура), но и разнообразными, в большинстве случаев слабыми химическими связями между отдельными звеньями полипептидных цепей, определяющими уникальную для каждого фермента вторичную и третичную структуры. Именно эта уникальная структура обеспечивает в ограниченных участках трехмерной глобулы белков-ферментов специфичную мозаику функциональных групп, синхронно участвующих в каталитическом эффекте. [c.7] В настоящее время при помощи весьма совершенных физикохимических методов предпринимаются исследования трехмерной структуры ферментов, но достижения в этой области пока довольно скромны и касаются единичных ферментов. [c.7] Известные успехи достигнуты в изучении роли отдельных функциональных групп ферментов в биокаталитических реакциях (5Н-группы остатков цистеина, ОН-группы остатков серина, имидазольный цикл остатков гистидина, е-ЫН 2-группы остатков лизина и т. п.). Но поскольку ферментативный катализ, несомненно, не сводится к участию только этих групп, то такие успехи решают лишь часть основной задачи. [c.7] В связи с этим возникает необходимость исследования механизма ферментативных реакций при помощи комплекса различных методов, которые общеприняты при изучении механизма сложных химических реакций. Среди этих методов особое место занимает кинетический метод. [c.7] Применение методов химической кинетики в исследовании механизма ферментативных реакций оказалось весьма плодотворным. Здесь энзимология опирается на огромный опыт органической и физической химии. [c.7] В химии ферментов ситуация не менее сложна, чем в такого рода процессах. Однако и здесь сохраняется принцип взаимозависимости скорости реакций, химических свойств и строения реагирующих веществ. Применение кинетического метода как в химии, так и в энзимологии зиждется на этом фундаментальном принципе, развитие которого в связи с созданием теории абсолютных скоростей и привело к возможности расчета скорости реакции для веществ с известным химическим строением. Такие расчеты удается, однако, пока провести для относительно простых по структуре веществ и простых механизмов реакции. Возможности приложения теории абсолютных скоростей к ферментативным реакциям еще менее изучены. [c.8] Однако экспериментальное изучение кинетики ферментативных реакций и количественная оценка кинетических констант реакций, проводимых при определенных условиях (pH, температура, состав среды, действие ингибиторов, активаторов и т. п.), часто позволяют делать опеределенные заключения о химической природе промежуточных соединений и механизме отдельных стадий процесса. [c.8] Разумеется, кинетический метод в ряде случаев дает возможность постулировать несколько альтернативных механизмов, отвечающих одной и той же кинетической схеме. В этом смысле необходима проверка таких постулатов при помощи каких-либо других независимых методов. Ценность кинетического метода заключается в том, что он позволяет однозначно отвергать механизмы, не отвечающие экспериментальным кинетическим данным. [c.8] Таким образом, сочетая метод ферментативной кинетики с другими методами, можно достичь максимальных результатов в изучении механизмов реакций. [c.8] Кинетический метод применительно к ферментативным реакциям имеет еще одно важное преимущество. Дело в том, что сложной проблемой энзимологии является выделение ферментов из биологического материала и их очистка вплоть до индивидуального состояния. Более того, не всегда могут быть точными критерии индивидуальности фермента. Все это в значительной мере затрудняет применение методов, обычно используемых в физической химии (например, спектральных и др.), при исследовании механизмов ферментативных реакций. [c.8] Необходимо упомянуть еще один частный случай, встречающийся в ферментативной кинетике. При измерении скорости расщепления нескольких связей в молекуле полимерного субстрата (например, белка, полисахарида, нуклеиновых кислот и т. п.), концентрацию субстрата следует выражать в гэквивалентах (число гмолей субстрата, деленное на число затронутых связей) яа литр. [c.9] В связи с тем, что скорость ферментативной реакции находится 8 определенной зависимости от концентрации фермента, то и для этой последней величины необходим такой же, как и для концентрации субстратов, способ выражения (т. е. гмоли на литр раствора). Однако в настоящее время это возможно далеко не для всех ферментов, поскольку немногие из них получены в индивидуальном состоянии и не во всех случаях надежно определен молекулярный вес ферментов. Помимо того, как оказалось, в одной молекуле фермента может содержаться несколько каталитических центров, и, следовательно, концентрация фермента может быть не равна концентрации каталитических центров. Все это осложняет положение, хотя в некоторых случаях молярную концентрацию каталитических центров удается определить при помощи прямых или косвенных методов (см. гл. IX) и использовать эту величину для вычисления кинетических констант. [c.9] Международного биохимического союза рекомендован единый условный способ выражения абсолютных количеств фермента. За единицу количества фермента (Е) принимается такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в 1 мин в стандартных условиях действия фермента (температура 25°, оптимальная концентрация субстрата и оптимальное значение pH). Производными единицами являются кило-Е (1000 Е) и милли-Е (0,001 Е). Содержание фермента в биологическом материале и в выделяемых ферментных препаратах может быть выражено числом единиц фермента на 1 мг веса или 1 мг белкового азота. Эта величина носит название удельной активности фермента. Сам по себе этот термин нельзя признать вполне удачным, поскольку здесь идет речь о содержании фермента в материале. Термин активность правильнее относить к свойствам фермента (см. ниже раздел Активность ферментов ). [c.10] Следует сказать, что вообще этот способ выражения для количества фермента нельзя считать совершенным. Как ясно из определения, он основан на измерении скорости катализируемой ферментом реакции. Однако эта скорость зависит не только от указанных выше условий, но также (как это будет показано ниже) от концентрации и активности фермента, ионной силы раствора и многих других факторов. Таким образом, наиболее правильной мерой абсолютного количества фермента должно быть число гмолей его или, нри неэквивалентности их числу каталитических центров, условное число гмолей активных центров гмоли фермента, деленные на число активных центров в молекуле). Разумеется, такой способ выражения будет находить все большее применение по мере получения индивидуальных ферментов и определения их молекулярного веса, а также концентрации активных центров. [c.10] Вернуться к основной статье