ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Концентрация белков, время уравновешивания и скорость потока из "Аффинная хроматография" В колоночной аффинной хроматографии достаточно сильное взаимодействие выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом приводит к концентрированию вещества и его медленной миграции вниз по колонке. Этот процесс зависит от концентрации лиганда и почти не зависит от начальной концентрации свободных макромолекул. Например, в аффинной хроматографии глицерокиназы или лактатдегидрогеназы на К -(6-аминогексил)-5 -АМР— сефарозе не наблюдалось влияния концентрации фермента на емкость, если концентрации ферментов прямо пропорциональны концентрациям нуклеотида или зависимость между ними близка к таковой [21]. Необходимые при этом требования заключаются в том, что комплементарные макромолекулы следует наносить на колонку в ненасыщающих количествах, а также подбирать скорость потока раствора [19]. [c.82] Возможны две причины появления выделяемого белка в свободном объеме элюата при высоких скоростях потока в перегруженных колонках. Первая обусловлена процессом, известном как вторичное исключение. Скорость диффузии молекул в гель зависит не только от размера пор, но также и от соотношения между размером молекул и объемом пор. При нанесении на гель концентрированного раствора высокомолекулярного вещества с крупными молекулами одни из этих молекул будут сразу диффундировать в доступные поры, однако для молекул, пришедших позже, многие поры уже окажутся занятыми, поэтому вероятность диффузии 3 занятые поры понижается из-за уменьшения объема доступных пор. Это приводит к исключению вещества из пор, содержащих иммобилизованный лиганд, ставший недоступным из-за уменьшения объема пор. Вторая причина обуслов.леня степнче-скими затруднениями для последующих молекул, создаваемых уже адсорбированными молекулами белка. Глобулярный белок среднего размера, такой, как гемоглобин, покрывает площадь около 2500 А- [19], что само по себе создает пространственные затруднения. [c.82] Влияние времени инкубации (уравновешивания) на емкость N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозы при связывании лактатдегидрогеназы в статических условиях [21] показано на рис. 5.10,6. Связываемость фермента иммобилизованным нуклеотидом наиболее круто растет вначале, затем кривая становится более пологой 100% фермента связывается через 16 ч, а 50%-ное связывание достигается за 20 мин. Данные сорбции химотрипсина на КНг-сфе-роне с присоединенными карбобензокси-о-фенилаланином приведены на рис. 3.1 они указывают, что равновесие достигается быстрее. На рис. 10.4 показано, как на достижение равновесия влияет разбавление. [c.85] Вернуться к основной статье