ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Введение из "Аффинная хроматография" Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помошью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела— с антигенами (против которых получены), а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография. [c.9] Из сказанного выше видно, что в настоящее время термин аффинная хроматография распространяется не только на методы, основанные на образовании комплексов в результате строго био-специфических взаимодействий. Напротив, этот термин стал настолько широким, что используется также и для обозначения метода выделения биологических макромолекул путем простой сорбции па специфическом сорбенте (который часто бывает даже одноразового употребления). По-видимому, этит термин не совсем точен, но сегодня он общепринят. [c.10] Идея методов разделения белков, основанная на сродстве молекул, которое обнаружено в биологических системах, известна несколько десятилетий (с тех пор, как стали привязывать ферменты к нерастворимым носителям). Нерастворимые гетерогенные катализаторы имеют определенные преимущества легкость выделения из реакционной смеси, возможность осуществления непрерывного катализа и повышение стабильности ферментов. Тем не менее по ряду причин полного развития аффинная хроматография и связывание ферментов с нерастворимыми носителями достигли лишь в последние годы. Развитие обоих направлений началось с использования высокопористых гидрофильных носителей, главным образом агарозы, после разработки подходящих методов связывания (Аксен и др. [1], Порат и др. [32]). [c.10] В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необ.ходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Примерами первых специфических сорбентов, приготовленных путем ковалентного связывания с нерастворимым носителем, были иммобилизованные антигены (Кемпбелл и др. [5]) . Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. В то же время ранее предложенный азидный способ привязки ферментов к целлюлозе [25] стал использоваться для приготовления иммуносорбентов. Параллельное развитие обоих направлений, основанных на использовании связывания биологически активных веществ с нерастворимыми носителями, наглядно демонстрируют названия первых обзорных статей Реакционноспособные полимеры и их использование для приготовления смол с антителами и ферментами (Манеке [23]), Водонерастворимые производные ферментов, антигенов и антител (Сильман и Качальский [39]) и Химия и использование производных целлюлозы для изучения биологических систем (Великий и Витол [47]). Оба направления продолжали развиваться параллельно и после открытия других более эффективных носителей и разработки методов связывания, позволяющих сохранять свойства иммобилизуемых веществ в растворе. [c.11] Такое параллельное развитие существенно способствовало созданию новой отрасли технологии — ферментной инженерии. Согласно Виньяру [48], последняя включает производство, выделение, очистку, иммобилизацию и использование ферментов в различного типа реакторах. Практическое использование ферментов стало возможным благодаря новейшим достижениям энзимологии, а именно после выяснения структур и механизмов действия ряда ферментов, имеются большие возможности для практического применения иммобилизованных ферментов в анализе, медицине и промышленности. Упрощение процесса выделения ферментов с помощью аффинной хроматографии, по-видимому, может привести к получению недорогих ферментов в требуемых количествах. [c.11] Иммобилизация ферментов на подходящих носителях значительно расширяет сферы их применения, которые, кроме того, стали и экономически целесообразными. Исследование различных типов ферментативных реакторов создает условия для их практического применения. Однако потребуется еще много усилий для воплощения мечты эпзимологов о том, чтобы ферменты как высокоспеци-фические катализаторы проникли в процессы производства. К сожалению, до сих пор имеется некоторый скептицизм относительно возможности достижения этой цели. [c.12] Однако ферменты, связанные с нерастворимыми подложками, важны не только с практической точки зрения. Ферменты, присоединенные к нерастворимым подложкам, имеющим хорошо охарактеризованную поверхность, представляют собой простые модели для изучения влияния микроокружения на связывание субстрата, а также на общий ход катализа, что имеет несомненно и теоретический интерес. Поскольку большинство ферментов in vivo связаны с мембранами или находятся в виде каких-то других комплексов в естественном окружении, исследования в этом направлении имеют особое значение. [c.12] Именно при изучении влияния микроокружения на специфические взаимодействия важную роль начинает играть метод аффинной хроматографии. Как подробно показано в гл. 4, возможно, напри.мер, использовать колонку с иммобилизованным ингибитором н вытеснять специфически сорбируемый фермент растворами его ингибиторов в различных концентрациях. Па основе объемов элюата могут быть рассчитаны константы диссоциации фермента как со связанным, так и с растворенным ингибитором. Если использовать тот же ингибитор для связывания на нерастворимой подложке и для элюирования специфически сорбированного фермента, то информацию о влиянии окружения на образование комплекса можно получить, основываясь на различиях, если таковые имеются, в величинах определяемых констант диссоциации. Поскольку специфические взаимодействия играют очень важную роль в большинстве процессов, протекающих в природе, разработка простого метода определения констант диссоциации комплексов несомненно имеет важное значение. [c.12] Аффинной хроматографии и связыванию ферментов с нерастворимыми носителями посвящено много обзорных статей [4, 6—9, 11 — 17, 26, 30, 31, 34, 35, 41, 42, 46]. [c.12] Вернуться к основной статье