ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Гель-хроматография из "Гель-хроматография" В рассмотренных выше опытах по введению трития в белки и нуклеиновые кислоты связь между макромолекулой и низкомолекулярным реагентом (ионы трития) была обратимой. Гель-фильтрация оказалась весьма полезным методом при изучении подобных обратимых взаимодействий. [c.146] Разделение экстракта (10 мл) из 2,88 г задней доли гипофиза на сефадексе 0-25 (4 X 60 см, 750 мл). Элюент 0,05 М уксусная кислота в 0,2 М пиридине (pH 5,9 190 мл1час). По оси ординат — поглощение после реакции с нингидрином. [c.147] Фракционирование 480 мг активной фракции из А, высушенной лио-фильно (после нагревания при 70° в 5 мл I М муравьиной кислоты в течение 10 мин) на сефадексе 0-25 (2,5 X 50 сМу 236 мл). Элюент 1 Л1 ИСООН (30 мл/час) стрелками указаны фракции, содержащие активные гормоны. [c.147] По оси ординат — поглощение после реакции Фолина -Лоури [29]. [c.147] Гель-фильтрация часто позволяет при условии тщательного проведения эксперимента количественно охарактеризовать состав [31] и устойчивость [32] таких комплексов. [c.148] Хаммел и Дрейер [31] уравновешивали сефадекс G-25 (0,4 X X 100 см) раствором 2 -цитидиловой кислоты (9 X 10 М) в 0,1 М ацетатном буфере, после чего в том же растворе в колонку вводили 2 мг рибонуклеазы. На диаграмме элюирования помимо пика с /Саю = О, соответствующего комплексу белок — цитидило-вая кислота, наблюдали минимум (с Kav = 0 по отношению к линии фона 2 -цитидиловой кислоты. Если в раствор образца постепенно добавлять все большие количества цитидиловой кислоты, то минимум становится менее выраженным и наконец сливается с линией фона. Концентрация -цитидиловой кислоты в этот момент соответствует точке насыщения комплекса фермент-ингибитор. При дальнейшем увеличении концентрации 2 -цитидиловой кислоты на диаграмме элюирования появляется пик с Kav — 1. [c.148] Мудд и Манн [32] усоверщенствовали этот метод (работая вначале с той же системой) и показали, что на основании результатов подобных экспериментов можно вычислить константу диссоциации комплекса. Они применили разработанную методику для количественного описания взаимодействия между ферментом, активируемым метионином, и различными субстратами (или коферментами) (см. также [156]). [c.148] Феноловый красный в сыворотке связывается исключительно с сывороточным альбумином, причем эта связь, обратимая при pH 8,5, наиболее прочна при pH 4,5 [33]. Гель-фильтрация позволяет использовать это явление для определения содержания альбумина в сыворотке. С помощью гель-фильтрации было показано, что прогестерон в плазме связан с двумя независимыми системами, различающимися по емкости и степени сродства к нему [34]. [c.149] Изучение растворимых комплексов антиген — антитело, образование которых особенно характерно для низкомолекулярных антигенов, представляет зачастую большие трудности. Здесь гель-хроматография также может иметь большое значение [35]. [c.149] Изучены также комплексы нуклеиновых кислот с низкомолекулярными соединениями. Комплекс дезоксирибонуклеиновой кислоты и актиномицнна i легко отделить от избытка антибиотика на сефадексе G-50 [36]. Образование такого комплекса специфично для ДНК и связано с механизмом действия актиномицнна. Впоследствии это явление было детально изучено Хартманом и др. [37]. [c.149] Если компоненты смеси незначительно различаются по молекулярному весу, их объемы выхода с колонки также очень близки. Поскольку рабочий объем колонки составляет определенную долю общего объема геля (см. стр. ПО, 111), то совершенно очевидно, что при прочих равных условиях разделение будет тем лучше, чем длиннее колонка. Конечно, пористость геля должна быть оптимальной для данного случая. Области применения различных гелей указаны в табл. 5, 8—10 и 15. Желательно использовать такой гель, чтобы в его гранулы совсем не мог проникать только один из компонентов исследуемой смеси. Если компоненты сильно различаются по молекулярному весу, то целесообразно проводить предварительное фракционирование на геле средней пористости. Затем низкомолекулярную и высокомолекулярную фракции можно хроматографировать повторно на соответствующих гелях. [c.150] По оси. ординат —концентрация в произвольных единицах. [c.151] Некоторые пентапептиды в концентрированном водном растворе при каталитическом действии пепсина могут вступать в реакцию поликонденсации с потерей воды (пластеиновая реакция). Смесь олигомеров пентапептида тирозил-лейцил-пролил-глутамил-фенилаланина была разделена на длинной колонке с сефадексом 0-25 (4,2X200 сж, 2,8 л) (фиг. 28). [c.153] Как видно из фиг. 29, для разделения ферментов поджелудочной железы наиболее подходит сефадекс 0-75. Это установили следующим образом. Три колонки одинакового размера (2X42 см, 130 мл) заполнили сефадексами разных типов. Для получения экстракта обезжиренную порошкообразную поджелудочную железу собаки в течение 30 мин обрабатывали 0,05М натрийацетатным буфером (pH 5,3) в 0,005 М ацетате кальция (5 мл па г порошка). На колонки наносили по 3 мл раствора и элюировали тем же буфером. Пик 1 соответствует липазе, 2 — рибонуклеаза, 3 — трипсиногену и химотрипсиногену, 4 —амилазе. [c.153] По оси ординат — поглощение после реакции ФОлина — Лоури. [c.155] По оси ординат — поглощение после реакции Фолина — Лоури. [c.156] Вернуться к основной статье