ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Различные замечания по работе из "Микробиологическое окисление" Просмотреть пробы под микроскопом. Однако часто он ограничивается оценкой внешнего вида и запаха. [c.219] Рост бактерий и дрожжей в культуре приводит в основном к образованию более или менее равномерно мутной суспензии клеток, имеющей вид тонкой эмульсии типа сливок в курином бульоне. pH такого раствора в конце наиболее энергичного роста микробов (к этому времени большая часть питательной среды бывает израсходована) может быть выше (pH 8) или ниже (pH 3) в зависимости от буферной емкости и природы входящих в состав раствора компонентов. Так, кукурузный экстракт, содержащий сложные (белковые) источники азота, будет иметь более высокое значение pH, чем среда, полученная из аммиака, глюкозы и других простых составляющих. Запах ее может изменяться от приятного дрожжевого (некоторые дрожжи) или приятно землистого (некоторые виды Streptomy es) до различной степени неприятных (например, запаха тухлой капусты). [c.219] С другой стороны, плесень (грибы) чаще вырастают в виде толстых матов (мягких листиков) или шариков, мраморных на вид и различающихся по цвету от желтого (или розового) до коричневого и черного. Если в колбе с культуральной жидкостью нет такого пышного роста культуры, то это в любом случае подозрительно, и такую культуру лучше не использовать. Запах плесени обычно не очень неприятный, иногда он может быть даже аппетитным, похожим на запах свежевыпеченного хлеба. Испорченные культуральные жидкости имеют чаще всего запах гнили. pH растворов при ферментации плесенью зависит от тех же факторов, которые уже обсуждались выше в случае бактерий и дрожжей. [c.219] Как добавлять субстрат Если микроорганизм не загрязнен и хорошо растет, то прибавлять к нему субстрат можно несколькими способами. В том случае, когда не требуется специального оборудования, следует открыть колбу, добавить в нее субстрат и снова закрыть колбу, естественно соблюдая все условия асептики. Правда, риск внести загрязнение в этом случае много меньше, чем в начале выращивания культуры, вследствие того что питание уже истощено, а сильно разросшаяся культура будет подавлять рост любого другого организма. Жидкие субстраты вносятся как таковые, а твердые субстраты, тщательно очищенные, иногда могут быть добавлены и сами по себе, но чаще всего используются их растворы. К счастью, обычно нет необходимости подвергать субстрат стерилизации, поскольку большинство органических соединений неустойчиво в условиях автоклавирования. Тем не менее для уменьшения риска внести загрязнение при применении водных растворов используют стерильную воду. [c.219] Если субстрат нерастворим в воде, его часто растворяют в смешивающемся с водой органическом растворителе. Однако для того чтобы избежать ингибирующего действия растворителя на микроорганизм, растворитель слел(ует брать в минимальном количестве. Чаще всего для этих целей используют этанол, ацетон, диметилсульфоксид и М, Ы-диметилформамид (ДМФ). Последний из них наиболее пригоден и не оказывает ингибирующего действия в количествах до 0,5% от общего объема культуральной жидкости. ДМФ нет необходимости стерилизовать, однако для того, чтобы убить любые случайно попавшие микроорганизмы, можно добавить 5 г фенола на каждый литр ДМФ. [c.220] Хотя добавление водонерастворимого субстрата, растворенного, например, в ДМФ, обычно адекватно его диспергированию, это не является единственным решением. Может оказаться, что субстрат все же не окисляется. В таком случае иногда неудача может быть превращена в успех добавлением в колбу диспергирующего агента, например икгаше 30-08. На первый раз его следует брать в количестве примерно 0,25% от общего объема культуральной жидкости. Стерилизовать это вещество нет необходимости. [c.220] Использование спор для окислительных реакций. Все предыдущие замечания касались использования вегетативных культур, применяемых в колбах, в которых они быстро прорастали после инокуляции небольшого количества спор или вегетативных клеток, причем большая часть материала относилась к промытым культурам. До сих пор эти два варианта техники работы[1] были наиболее распространены, однако более современным способом проведения ферментации, по крайней мере с точки зрения химика, является использование разного рода спор в непитательной среде, где они не могут прорастать и размножаться. В будущем пересылка спор и различных микроорганизмов станет коммерчески доступной. Их можно будет подобно химическим реагентам купить и положить на полку (или в холодильник), пока они не понадобятся, а затем смешать с возможным субстратом, уделяя минимум внимания вопросам асептики. [c.220] Где находится продукт Продолжительность инкубации субстрата с момента его прибавления к микроорганизму может быть произвольной (например, 24, 48 или 72 ч), однако лучше контролировать протекание реакции, отбирая из сосуда небольшие пробы (соблюдая все правила асептики) с последующим их анализом (например, экстракцией и тонкослойной хроматографией). Ферментацию можно остановить, поместив колбу или ферментер в холодную комнату или холодильник. Здесь сосуд с суслом можно оставить стоять до того момента, как вы приступите к выделению продукта (продуктов) реакции. [c.220] Прежде всего центрифугированием или фильтрацией (последняя часто облегчается при использовании целлитных фильтров) следует отделить клетки микроорганизма от сусла. Последующая экстракция чистого сусла (для начала рекомендуется использовать хлористый метилен) и анализ экстракта покажет, где находится продукт реакции. Следует заметить, что в экстракте могут находиться и водонерастворимые вещества. [c.221] Процесс выделения из чистого сусла ничем не отличается от обычной химической процедуры. В то же время выделение нз самого организма (такого рода твердые объекты называют пленками, лепешками, мицелием или шариками) 1йожет потребовать известной изобретательности, особенно если необходимо разрушить клетки. В таком случае удовлетворительные результаты может дать экстракция ацетоном или другим подходящим растворителем. К сожалению, обработка клеток большинства микроорганизмов органическими растворителями приводит также к экстракции стеринов и других липидов, что осложняет дальнейшие исследования. Поэтому химик Должен стремиться сделать всегда все от него зависящее, чтобы обнаружить продукт реакции в чистом сусле. [c.221] Фильтры (лепешки) обязательно следует дезинфицировать, для чего также проще всего воспользоваться 5%-иым раствором фенола. Что же касается культуральной жидкости, оставшейся после экстракции, то мало вероятно, чтобы там остались живые клетки. Поэтому ее можно спокойно выбросить без дальнейшей обработки. [c.221] Вернуться к основной статье