ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Полимеразная цепная реакция из "Медицинская и санитарная микробиология" Молекулярно-биологические методы диагностики позволяют обнаружить в образцах, взятых от больного, при вскрытии или из окружающей среды молекулы НК возбудителя. Их специфичность обусловлена индивидуальностью геномов — нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК организмов и основана на принципе комплементарности — соответствии друг другу нуклеотидных пар (А-Т, Г-Ц), позволяющем гибридизоваться сходным фрагментам НК (в том числе эталонному и искомому фрагментам). Высокую чувствительность эти методы приобрели с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). [c.93] Суть ПЦР состоит в циклическом удвоении (амплификации) определенного участка ДНК с помощью специфических праймеров (затравок) особых ферментов-полимераз. После первого цикла из одного фрагмента ДНК образуется два, после второго — четыре и далее увеличение количества ДНК идет в геометрической прогрессии. В конечном итоге, даже если в образце присутствовала всего одна молекула НК, образуется достаточное количество ДНК, чтобы ее можно было легко выявить обычными физико-химическими методами — хроматографией или электрофорезом. [c.93] Для того чтобы удвоение (амплификация) началось, необходимо иметь олигонуклеотидную последовательность из 20 — 30 аминокислотных остатков, комплементарную определенному участку ДНК возбудителя (праймер). Праймеры получают, исходя из известных генов различных возбудителей, в специальных аппаратах — синтезаторах. [c.93] Необходимо подчеркнуть, что обязательным условием проведения полимеразной цепной реакции является знание нуклеотидной последовательности того или иного объекта исследования (вирус, бактерия и др.). В настоящее время в банках данных имеются практически полные сведения о геноме различных патогенньгх микробов. [c.93] Для проведения ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей двунитчатой молекулы ДНК. При этом 3 -концы этих синтетических олигонуклеотидов должны быть направлены навстречу друг другу (рис. 1.31). [c.94] Для начала реакции в одной пробирке собирают исследуемую ДНК, два праймера, дезоксинуклеозид-трифосфаты четырех видов, фермент полимеразу, выделенную из термофильных микроорганизмов ТИегти5 адиаИсиз и буферную смесь, оптимальную для работы данной полимеразы. Полученную смесь прогревают в течение 1 мин при 94 °С, при этом комплементарные нити ДНК разъединяются. Этот этап называют денатурацией ДНК ( плавлением ). [c.94] Затем температуру снижают до 45 — 65 °С (в зависимости от состава олигонуклеотидов) и выдерживают ее 1,0— 1,5 мин. При этом к образовавшимся в результате денатурации одноцепочечным ДНК присоединяются праймеры — один к 3 -концу выбранного для удвоения участка, второй — к 5 -концу. Этот этап называют отжигом . На третьем этапе поддерживается температура 72 °С. Это оптимальная температура для работы применяемой в ПЦР полимеразы. Данный фермент, используя дезоксинуклеозидтрифосфа-ты, содержащиеся в смеси, достраивает комплементарные цепи ДНК, начиная с 3 -концов праймеров навстречу друг другу. Этот этап называется элонгация (удлинение). [c.94] Как правило, проводится 30 циклов, что теоретически позволяет получить копий участка ДНК возбудителя. [c.94] Вернуться к основной статье