ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Определение первичной структуры нуклеиновых кислот из "Биологическая химия" Совершенно иначе обстоит дело с ДНК. У многих бактерий найдены ферменты, которые гидролизуют двунитевую ДНК по участкам, обладающим строго определенной последовательностью из нескольких нуклеотидов, чаще всего четырех или шести. Такие фрагменты встречаются довольно редко — в среднем соответственно один на 256 для фрагментов из четырех нуклеотидов или один на 4048 для фрагментов из шести нуклеотидов, т.е. фрагменты в среднем имеют значительную длину, а число фрагментов со строго определенной последовательностью не очень велико. Расщепление обеих нитей происходит по участкам, которые для большинства ферментов этой группы построены из двух идентичных фрагментов или, как принято говорить, самокомплементарны. [c.276] Эти ферменты известны под общим названием эндонуклеазы рестрикции. Термин эндонуклеаза означает, что фермент катализирует расщепление нуклеиновой кислоты по внутренним фосфодиэфирным связям в отличие от зкзонуклеаз, катализирующих отщепление концевых звеньев нуклеиновой кислоты (к их числу относится упоминавшаяся в 7.3 фосфодиэстераза из змеиных ядов). Сокращенно эндонуклеазы рестрикции называют рестриктазами. В табл. 7.5 перечислены некоторые из наиболее широко используемых при изучении структуры ДНК и других биохимических исследованиях рестриктазы. [c.276] С помощью рестриктаз удается расщепить большие молекулы ДНК на фрагменты умеренной длины, которые, как правило, мог) быть разделены электрофорезом. Совпадение длин двух фрагментов, которое воспрепятствовало бы разделению, — событие маловероятное. В том случае, если все же это происходит, следует воспользоваться ферментом другой специфичности. [c.276] Участки ДНК, по которым происходит расщепление той или иной рестрикта-зой, называют сайтами рестрикции. Поскольку эндонуклеазы рестрикции используются не только для подготовки ДНК к секвенированию, но и для других целей, в частности для генной инженерии (см. 7.11), распределение сайтов рестрикции вдоль молекулы ДНК является важной характеристикой ДНК. Установление взаимного расположения этих сайтов называют физическим картированием ДНК, а саму схему такого распределения — физической картой ДНК. [c.276] Почти одновременно было предложено два метода, основанных на одной принципиальной идеологии, хотя резко отличаюпц1хся по своему химическому содержанию. Эти методы известны как метод Максама - Гилберта и метод Сэнгера. [c.278] На втором этапе гомогенный, меченный по 5 онцу полинуклеотид подвергается в четырех отдельных пробах химической обработке, приводящей к специфическому или, по крайней мере, преимущественному расщеплению по одному из четырех типов нуклеотидньгх остатков. Используемые химические реакции приведены ниже. Существенным моментом этого этапа является проведение каждой из четырех реакций на такую глубину, что в среднем на каждую цепочку приходится один разрыв. Это нетрудно осуществить путем подбора времени реакции и концентраций используемых реагентов. В итоге в каждой из четырех проб Свиди-мыми в только что упомянутом смысле этого слова остаются фрагменты исходного полинуклеотида, содержащие неповрежденный 5 -конец и обрезанные по всем мыслимым точкам, содержащим определенный тип нуклеотида. [c.278] На третьем этапе проводится электрофорез всех четырех проб в полиакриламидном геле. Для того чтобы условия разделения были идентичными во всех четырех пробах, пробы наносят на один гель и разделяют на четырех параллельных дорожках этого геля. Разделение, как уже говорилось в 7.1, проходит по длине, и положение каждого фрагмента, детектируемое радиоавтографически, дает его длину, а тем самым и положение соответствующего мономера в исходной цепи. Таким образом, на одной дорожке, если речь идет о ДНК-фрагменте, определяется положение всех остатков тимидина, на другой — всех остатков дезокси-цитидина, на третьей — всех остатков дезоксигуанозина и на четвертой — всех остатков дезоксиаденозина. В сумме это дает положение в исходном полинуклеотиде всех мономеров, а это и означает, что определяется его первичная структура. Эта структура в один прием считывается с геля, причем при достаточной длине дорожки геля одновременно может быть определено расположение сотен мономерных звеньев. Идеализированная схема такого разделения и определяемая последовательность приведены на рис. 77. [c.278] В 66%-ной муравьиной кислоте протонируются как остатки гуанина, так и остатки аденина, в результате чего происходит апуринизация по обоим типам гетероциклов. При последующей обработке пиперидином происходит расщепление цепи в первом случае только по остаткам дезоксигуанозина, во втором — по обоим пуриновым нуклеотидам. В итоге при радиоавтографии геля на первой дорожке выявляются все остатки, соответствующие гуанинам, на второй — и гуанинам и аденинам. Очевидно, что эТой информации достаточно, чтобы раздельно определить положения в цепи обоих пуриновых нуклеотидов. [c.280] Изложенный метод с точки зрения канонов классической аналитической химии противоестествен. Для установления структуры гомогенного полинуклеотида его превращают в чрезвычайно сложную смесь фрагментов. Но именно это дает возможность после проведения электрофореза с одного геля сразу прочесть структуру, состоящую из многих десятков, а в некоторых случаях даже из нескольких сотен звеньев. Это связано со спецификой объекта — биополимера, построенного из большого числа заранее изученных и не слишком разнообразных структурных элементов. [c.280] Практически параллельно с методом Максама — Гилберта был развит другой метод секвенирования ДНК, получивший по имени создавшего его автора название метод Сэнгера. Этот метод считается наиболее перспективным для исследования первичной структуры больших молекул нуклеиновых кислот, вплоть до ДНК хромосом человека. В бго основе лежит анализ структуры не самой нуклеиновой кислоты, а продукта, получаемого в ходе ее репликации с помощью ДНК- юлимеразы. Аналогично, используя обратную транскрипцию, с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы можно анализировать структуру молекул РНК. [c.281] Необходимо также добавление праймера (см. 5.1), комплементарного некоторому участку исследуемой матрицы. Структура участка должна быть заранее установлена, этого можно достигнуть, например, анализом последовательности нуклеотидов небольшого фрагмента исследуемой ДНК методом Максама — Гилберта. [c.281] В исходном варианте для изложенного метода определения последовательности нуклеотидов использовали дезоксинуклеозид-5 -трифосфат, меченный радиоактивными изотопами Щ или в а-положении трифосфатной группы. Радиоактивная метка попадала в каждое звено синтезируемой цепи, что обеспечивало высокую чувствительность метода. [c.282] Вернуться к основной статье