ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Хранение, регенерация и ремонт колонок для ВЭЖХ из "Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография" Оборудование, необходимое для получения узких фракций силикагеля в количествах, достаточных для ВЭЖХ, может быть очень несложным несколько одинаковых термостойких химических стаканов, стеклянные палочки с резиновыми наконечниками, секундомер или часы, сушильный шкаф, дистиллятор для получения воды в достаточных для работы количествах. Желательно, но не обязательно иметь систему для ультразвуковой обработки суспензий. Если исходный силикагель кусковой, нужно иметь для помола мельницу достаточной производительности, не загрязняющую размалываемый силикагель (например, даровую фарфоровую). [c.112] Если исходный силикагель берут в готовом виде, например, силикагель для ТСХ марки Л 5/40 производства ЧССР (он должен быть без связующего гипса и без УФ-индикатора), то процесс его размола отпадает. Перед тем, как начинать седиментацию этого или другого молотого силикагеля, желательно рассмотреть под микроскопом каплю его суспензии при увеличении в 100—500 раз с мерной шкалой с целью установить, присутствуют ли в достаточном количестве частицы размером от 3 до 2 мкм. Если они практически отсутствуют, значит, необходим дополнительный размол. [c.112] Одночасовой осадок суспендируют, осторожно перемешивая стеклянной палочкой с резиновым наконечником в воде, доливают воду до высоты слоя 12 см и оставляют на 20 мин. Осадок отбрасывают, суспензию переливают в другой стакан, доливают воду до 12 см, перемешивают и оставляют на 1 ч. Выпавший одночасовой (второй) осадок оставляют в стакане, суспензию переливают в другой стакан, доливают воду до высоты слоя 12 см, перемешивают и оставляют на 2 ч. Выпавший осадок оставляют, а суспензию выливают. Выпавшие за 20 мин и за 2 ч осадки, которые уже имеют заметно суженный фракционный состав, собирают отдельно и в дальнейшем, по мере их накопления, сужают дальше или же используют для высокоэффективной ТСХ или препаративной ЖХ. [c.113] Второй одночасовой осадок обрабатывают как первый одночасовой, получая конечный сорбент — третий одночасовой осадок, который имеет средний размер частиц около 14 мкм и узкий фракционный состав, что хорошо видно при рассмотрении под микроскопом капли его суспензии при увеличении в 100—200 раз. [c.113] Аналогичная обработка двухчасового осадка (интервалы времени соответственно меняются на 40 мин, 2 и 4 ч) позволяет получить конечный сорбент —третий двухчасовой осадок, который имеет средний размер частиц около 9 мкм и узкий фракционный состав. При такой же обработке четырехчасового осадка (интервалы времени 80 мин, 4 и 8 ч) получают третий четырехчасовой осадок, представляющий собой узко фракционированный конечный сорбент с частицами размером около 5 мкм. [c.113] Полученные сорбенты сушат в стаканах при температуре около 150 °С в сушильном шкафу 6 ч до постоянной массы, после чего охлаждают в эксикаторе и аккуратно пересыпают в широкогорлые склянки, плотно закрывающиеся пробкой. Пересыпать сорбенты следует под вытяжкой, так как они пылят, а пыль вредна для органов дыхания. [c.113] Из 1 кг исходного силикагеля для ТСХ получается по 20—40г. каждого из сорбентов, т.е. около 70—80 г. При дальнейшем сужении промежуточных фракций тем же способом выход их еще несколько повышается. Промежуточные фракции можно использовать и для других видов хроматографии (ТСХ) или других вариантов ЖХ (полупрепаративные или препаративные разделения, очистка образцов и т. п.). [c.113] Описание получения сорбентов для ВЭЖХ, представленное выше, показывает, что процесс несложен и достаточно производителен. Полученные сорбенты по качеству не уступают имеющимся в продаже, а иногда превосходят их. [c.113] Однако при получении сорбентов этим способом следует тщательно соблюдать ряд условий. Прежде всего все операции необходимо проводить с одной партией исходного силикагеля. Нужно строго соблюдать постоянство высоты слоя суспензии в стаканах и интервалы времени. В случае ошибки всегда лучше снова взмутить суспензию и повторить седиментацию правильно. Не следует применять больших усилий при взмучивании осадка, так как это может привести к раздавливанию большого количества частиц и ухудшению фракционного состава осадка. Наконец, при возможности нужно проводить ультралевую обработку каждой суспензии, так как это способству-ет разрушению слипшихся частиц (комочков) и отделению от частиц прилипших к ним субмикронных пылевидных частиц наличие которых ухудшает проницаемость и эффективность колонок с таким сорбентом. [c.113] Поэтому можно принять за правило, начиная работу по получению сорбентов для ВЭЖХ из силикагеля новых видов или партий, не делать сразу большую порцию, а получить 4—6 г сорбента и испытать его, заполнив несколько колонок при разных давлениях и испытав их характеристики. Если, например, уже при давлении набивки около 20 МПа колонка имеет резко увеличенное (по сравнению с другим сорбентом из механически прочного силикагеля той же фракции) сопротивление потоку растворителя, то трудно рассчитывать на то, что удастся получить высокоэффективные колонки, заполненные сорбентом этого вида с частицами размером около 5 мкм. Если же колонки, заполненные при 20, 40 и 60 МПа, имеют близкую проницаемость, можно делать большую партию сорбента и быть уверенным в ее качестве. [c.114] Приготовление колонок для ВЭЖХ из частиц сорбента размером от 3 до 12 мкм долго было для специалистов по ВЭЖХ труднопреодолимой проблемой. Так как при измельчении любых твердых тел их поверхность контакта резко возрастает, мелкие частицы приобретают способность заряжаться, слипаться в трудно разрушаемые комочки либо отталкиваться друг от друга с образованием неравномерно распределенных пустот. [c.114] Сорбент в заполненной традиционным методом насыпай и уплотняй постукиванием колонке для КХ после того, как в нее подавали растворитель, уплотнялся с образованием пустот в начале колонки, при этом форма пиков получалась неправильной, а эффективность колонки — низкой. [c.115] Разработка суспензионных методов приготовления колонок позволила резко поднять эффективность и использовать сорбенты размером 10 мкм и меньше. Однако суспензионный метод еще недостаточно отработан, и существует множество его вариантов, каждый из которых имеет свои особенности. Часто тот вариант, который описан в литературе, не дает в других руках хороших результатов, так как невозможно описать и воспроизвести все детали процесса суспензионной упаковки. [c.115] Вкратце процесс суспензионной упаковки выглядит следующим образом. Взвешивают требуемое для колонки данного размера количество сорбента, заливают его растворителем и приготавливают суспензию, тщательно перемешивая смесь, нередко с использованием ультразвука. После этого суспензию помещают в резервуар, соединенный с колонкой, на конце которой установлен фитинг с фильтром (рис. 5.1), и под давлением 20—60 МПа продавливают суспензию через колонку, подавая резервуар насосом растворитель. Суспензия фильтруется на фильтре колонки, формируя упорядоченный слой сорбента, обеспечивающий эффективное разделение при ВЭЖХ. Останавливают поток растворителя, дают давлению упасть до нуля и снимают колонку. Аккуратно удаляют избыток сорбента с конца колонки, присоединявшегося к резервуару, и присоединяют второй фитинг с фильтром. Полученную таким образом колонку устанавливают на хроматограф, прокачивают через нее до установления равновесия рабочий растворитель, после чего она готова к работе. [c.115] При всей кажущейся несложности процесса суспензионной упаковки колонок для ВЭЖХ у начинающего хроматографиста, так же как и у имеющего опыт, но начинающего работать с новым сорбентом, возникает ряд вопросов. Какой растворитель взять для приготовления суспензии Какую концентрацию суспензии использовать Как лучше диспергировать сорбент Какой формы и объема применить резервуар для суспензии Какой насос лучше для подачи растворителя Какое направление потока растворителя выбрать и какой взять растворитель Какое давление использовать и сколько растворителя подавать Сколько времени снижать давление Как выравнивать слой сорбента и устанавливать фитинг и фильтр На каждый вопрос существует ряд ответов, а выбор удачной комбинации вариантов всегда обусловлен не только собственным опытом, но и какими-либо общими представлениями, литературными данными и, наконец, имеющимся в наличии оборудованием. [c.115] Растворитель для приготовления суспензии часто является определяющим фактором для качества упаковки. Так как суспензия должна сохранять стабильность, начиная от переноса ее в резервуар в течение всей упаковки, необходимо замедлить седиментацию или исключить ее. Для этого существует ряд способов. Один, называемый методом сбалансированной плотности и широко используемый, заключается в выборе растворителя с той же плотностью, что имеет силикагель. Этот растворитель состоит из смеси полигалогензамещенных углеводородов (обычно смесь тетрабромэтана и тетрахлорида углерода) так как плотность его равна плотности силикагеля, седиментации не происходит сколь угодно долго. Недостатком этого способа является высокая токсичность, дороговизна и трудность удаления из колонки полигало-генированных растворителей. Другой способ, называемый методом высокой вязкости , состоит в выборе растворителя с высокой вязкостью, в котором седиментация сорбента происходит достаточно долго. Обычно это растворители, содержащие глицерин, этиленгликоль или циклогексанол. Недостатком этого способа является длительность упаковки, доходящая до нескольких часов. Третий способ, называемый динамическим , состоит в использовании растворителей малой вязкости, упаковка при этом протекает быстро для улучшения стабильности и уменьшения седиментации иногда используют перемешивание суспензии магнитной мешалкой в процессе всей упаковки. [c.116] Существует множество комбинированных методов, в которых используют элементы трех указанных способов в разном сочетании и с добавлением ПАВ, кислых и щелочных агентов, солей и др. При выборе растворителя следует иметь в виду, что он может давать с разными сорбентами истинные суспензии, осаждающиеся в соответствии с законом Стокса (в них частицы распределены в виде индивидуальных частиц), и скленные суспензии, осаждающиеся много быстрее и содержащие комочки из нескольких частиц сорбента. [c.116] Выбирая растворитель для приготовления суспензии, необходимо учитывать условия работы колонки. Так, силикагель разует устойчивые суспензии в воде, особенно при добавлении к ней для стабилизации аммиака до 0,001 М раствора. Однако после упаковки силикагель будет полностью дезактивирован водой и для применения в качестве адсорбента потребуется его тельная активация с использованием больших объемов абсолютного метанола или других растворителей. [c.116] Вернуться к основной статье