ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Полимеразная цепная реакция из "Молекулярная биотехнология принципы и применение" Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация - иногда в миллионы раз - осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для ПЦР необходимы 1) два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной примерно по 20 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишень их 3 -гидроксильные концы после отжига с ДНК должны быть ориентированы навстречу друг другу 2) ДНК-мишень длиной от 100 до -35 ООО п. п. 3) термостабильная ДНК-по-лимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95° и выше 4) четыре дезокси-рибонуклеотида. [c.94] Типичная ПЦР-амплификация состоит в многократном повторении следующих трех реакций. [c.94] Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляются автоматически. Каждый цикл обычно длится 3-5 мин. [c.94] Во втором раунде двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и новосинтезированной ( длинная матрица ) цепей, опять подвергают денатурации, а затем отжигают с праймерами. Во время синтеза в этом раунде вновь синтезируются длинные матрицы , а также некоторое количество цепей с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймеру, на другом ( короткие матрицы ) (рис. 5.19). Во время третьего раунда все гетеродуплексы, образовавщиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплицируются (рис. 5.20). В последующих раундах коротких матриц становится все больше, и к 30-му раунду их число уже в Ю раз превышает число исходных цепей или длинных матриц (рис. 5.21). [c.96] Метод ПЦР получил широкое распространение. Разнообразные случаи его применения мы рассмотрим в последующих главах. Здесь упомянем лишь некоторые из них. Один из важнейших - идентификация патогенных микроорганизмов, возбудителей заболеваний человека, животных и растений. С появлением ПЦР отпала необходимость в выделении и очистке ДНК-мишени для анализа можно использовать очень небольшое количество неочищенного материала. Для синтеза праймеров, специфичных в отношении исключительно ДНК-мишени, нужно знать нуклеотидную последовательность ДНК предполагаемого патогенного микроорганизма. В этом случае в ходе ПЦР будет амплицициро-ваться только фрагмент ДНК, длина которого равна суммарной длине двух праймеров и фрагмента ДНК между ними. [c.96] ИЗ одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду. [c.97] Вернуться к основной статье