ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы культивирования из "Введение в биотехнологию" В природе встречается множество микроорганизмов. Но в производстве для микробиологического получения различных веществ используют главным образом чистые культуры, т. е. однородные популяции микроорганизмов одного определенного вида и штамма. Чистую культуру обычно получают из одной изолированной клетки, которую потом постепенно размножают в стерильной среде. Эту работу проводят в стерильном боксе. Чистую культуру удобно изолировать, используя твердые среды Коха — агар, желатин и др. Если на поверхность твердой среды посеять достаточно разведенную суспензию микроорганизмов, то в благоприятных условиях вокруг каждой клетки культуры образуется островок однородных клеток — колония (см. приложения 6 и 7). Клетки из одной колонии при помощи петли или иглы в стерильных условиях переносят в стерильную среду, где они продолжают размножаться. [c.67] Для изолирования культур используют также метод Линдне-ра. Согласно этому методу на покровное стекло кончиком пера наносят ряды капель культуры различного разведения и рассматривают в микроскоп каждую каплю. Каплю, где находится только одна клетка, с помощью кусочка стерильной фильтровальной бумаги переносят в стерильную среду. Отдельную клетку из препарата под микроскопом можно изолировать манипулятором. [c.67] Получая чистые культуры анаэробных микроорганизмов, работу проводят так, чтобы культура развивалась без доступа воздуха, например используют стеклянные трубочки — капилляры, пастеровские капиллярные пипетки и др. [c.67] В дальнейшем проводят определение всех морфологических и физиологических свойств изолированных культур и определяют их систематическое положение. Чистые культуры аэробных микроорганизмов чаще всего сохраняют в виде цепочки колоний, растущих на косом агаре. Пробирки с чистыми культурами хранят в холодильнике (О—4°С), не менее 2—4 раз в год и чаще культуры пересевают. Для каждой чистой культуры составляют паспорт, где подробно дается ее описание. [c.67] В институтах микробиологии и на микробиологических заводах создают коллекции чистых культур — музеи. Всесоюзная коллекция чистых культур микроорганизмов организована при Институте микробиологии АН СССР. [c.67] Коллекции промышленных культур микроорганизмов находятся при отраслевых (головных) институтах. [c.67] Для изучения физиологических свойств культуру выращивают в стерильной среде, наблюдают за ее ростом, следят за расходом питательных веществ и синтезом нужного продукта. Для выращивания аэробных микроорганизмов используют глубинный и поверхностный методы культивирования. [c.68] При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешенном состоянии. В небольшую (50—250 мл) колбу наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру либо с поверхности косого агара, либо из ампул. Затем колбу на сутки или более помещают в термостат с определенной температурой, где культура растет и размножается. Чисто аэробные микроорганизмы выращивают в специальных колбах, которые ставят на качалку в термокамере. После этого культуру пересевают в лабораторные ферментаторы со средой такого же или несколько измененного состава. Лабораторные ферментаторы — стеклянные аппараты емкостью 1—10 л, в которых можно обеспечить продувание среды воздухом, регуляцию температуры, pH и других условий роста. По описанной выше схеме обычно организуют исследование культур микроорганизмов. Кроме того, таким путем готовят и чистую культуру для производственных нужд. Дальнейшее размножение чистой культуры в производственных условиях идет в несколько стадий при использовании металлических инокулято-ров объемом от 0,1 до 100 м и более. Инокуляторы снабжены мешалками, аэраторами, устройствами для стерилизации и охлаждения, арматурой, измерительными приборами. Для каждой следующей стадии необходимо 3—20% посевного материала (по объему). [c.68] Последнюю стадию, в которой получают нужный продукт, называют рабочей ферментацией. В культуральной жидкости, полученной после нее, суспендированы микробная биомасса, остатки питательной среды и экстрацеллюлярные метаболиты. Методами химической технологии из культуральной жидкости получают биомассу или нужное вещество — спирт, кислоту, аминокислоту, антибиотики и пр. [c.68] Используя метод поверхностных культур, микроорганизмы выращивают на твердых средах (влажные отруби и др.) или на жидких средах, залитых тонким слоем (2—20 см) в специальные кюветы. В этом случае биомасса располагается на поверхности среды. Чаще всего этим методом выращивают грибы, например культуры рода Aspergillus, используемые для получения лимонной кислоты и ферментов. Сначала размножают споры, которыми инфицируют стерильную среду. В камерах с кюветами поддерживают нужную температуру и обеспечивают аэрацию — циркуляцию воздуха между кюветами. [c.69] Культивирование микроорганизмов может быть непрерывным и периодическим. При периодическом процессе весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют посевной материал и при оптимальных условиях продолжают процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы или определенного метаболита. В ходе периодического культивирования изменяется темп роста культуры, ее морфология и физиология. За время культивирования меняется состав среды — уменьшается концентрация питательных веществ, увеличивается содержание метаболитов. С физиологической точки зрения периодическое культивирование невыгодно. В ходе его возникает также ряд технологических трудностей — циклический ход операций, сменные режимы, что затрудняет контроль и регуляцию процесса. [c.69] Указанные недостатки устраняются при непрерывном культивировании, методы которого разработали С. В. Лебедев, А. А. Андреев, Н. Д. Иерусалимский и другие ученые. Из непрерывных процессов лучше всего разработан метод глубинной ферментации. В этом случае в ферментатор с культурой продуцента непрерывным потоком подается стерильная среда, а из него непрерывно вытекает готовая культуральная жидкость. Процесс может быть гомо- и гетерогенно непрерывным. При гомогенно непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры (концентрация питательных веществ, клеточный титр и др.) постоянны во времени. При гетерогенно непрерывном процессе несколько ферментаторов соединены вместе и образуют каскад. Питательная среда поступает в первый ферментатор и готовая культуральная жидкость вытекает из последнего ферментатора. Культивирование микроорганизмов в протоке через систему трубок также идет по принципу гетерогенно непрерывного процесса ферментации. В этом случае имеет место непрерывный поток питательной среды, но клетки не обеспечены постоянными условиями роста (сколько аппаратов, столько и условий культивирования). [c.69] При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо отрегулировать такую скорость притока питательной среды и вытекания культуральной жидкости, чтобы предотвратить вымывание культуры из системы, т. е. концентрация клеток должна быть постоянной. В стерильных условиях непрерывный, или проточный, метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время. [c.70] Если х=/), то с1Х1сИ = 0. Это значит, что концентрация клеток неизменна. Чаще всего это бывает при = 0,05- 0,20. [c.70] Кй—константа Михаэлиса, численно равная концентрации лимитирующего фактора 3, при которой удельная скорость роста культуры равна половине максимальной удельной скорости роста. [c.70] Следовательно, в полноценной среде скорость роста культуры не зависит от концентрации лимитирующего фактора (исключая те случаи, когда концентрация слишком мала). [c.71] Р — концентрация продукта — метаболита, г/л. [c.71] Из уравнения видно, что увеличение концентрации метаболита Р уменьшает удельную скорость роста. Это подтверждено на практике. [c.71] А —содержание биомассы в жидкости оттока, мг/мл, г/л. [c.72] Вернуться к основной статье