ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Определение чистоты выделенной культуры из "Руководство к практическим занятиям по микробиологии Изд.3" После того как получена накопительная, приступают к выделению чистой культуры. Чистая культура может быть получена из отдельной колонии или одной клетки. [c.73] Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов является метод, предложенный Р. Кохом. Принцип его заключается в получении чистой культуры из отдельной колонии. Однако этот метод неприменим для выделения микроорганизмов, которые не растут или плохо растут на плотных средах. К числу таких микроорганизмов относятся некоторые бактерии, многие водоросли и простейшие. [c.73] При выделении чистой культуры аэробных микроорганизмов накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды. Порядок работы следующий. Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар или желатину, разливают в стерильные чашки Петри. После того как среда застынет, на ее поверхность из пипетки наносят каплю накопительной культуры или ее разведения в стерильной воде и стерильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют каплю сначала по одной половине поверхности среды в чашке Петри,. [c.73] Изолированные колонии аэротолерантных микроорганизмов и факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного посева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15—20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную баню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений накопительной культуры в стерильной водопроводной воде. Разведения готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0,5—1,0 мл разведения получить изолированные колонии. Степень разведения определяется плотностью накопительной культуры. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений. Для этого в пробирку с расплавленной и остуженной до 48—50° агаризованной средой вносят 0,5—1,0 мл одного из разведений накопительной культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри. После того как агаризованная среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии, выросшие в, толще среды, вырезают стерильным скальпелем или извлекают стерильными капиллярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. [c.77] Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев проводят на поверхность среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения накопительной культуры проводят в расплавленной и охлажденной до 45—50 агаризованной питательной среде. Делают 6—10 последовательных разведений. Затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (соотношение 3 1), что препятствует проникновению воздуха в толщу агаризованной среды. [c.77] Для получения изолированных колоний методом глубинного посева и методом разведений рекомендуется использовать осветленные пита-А тельные среды. [c.78] Когда хотят получить изолированные колонии облигатных анаэробных бактерий, характеризующихся особенно высокой чувствительностью к кислороду (экстремальные анаэробы), используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Сущность этого метода заключается в следующем. Расплавленную агаризованную среду засевают бактериям при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. Агаризованная среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя агаризованной среды в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом (рис. 42). [c.78] Чистую культуру из одной клетки можно выделить капельным методом, с помощью микроманипулятора или микроселектора. [c.79] Капельный метод Линднера используют при работе с крупными микроорганизмами дрожжами, мицелиальными грибами, водорослями. Порядок работы следующий. Накопительную культуру разводят в стерильной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле были одиночные клетки микроорганизмов. Затем на поверхность стерильного покровного стекла стерильным стальным пером наносят ряд капель приготовленного разведения. Готовят препарат висячая капля . Нанесенные на покровное стекло капли просматривают под микроскопом и отмечают те, в которых обнаружена только одна клетка. После этого препарат помещают в термостат во влажную камеру, которой обычно служит чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне. Череа 12—24 ч отмеченные капли вновь микроскопируют. Те капли, в. которых наблюдается образование микроколоний, осторожно снимают с покровного стекла кусочками стерильной фильтровальной бумаги и переносят в пробирки со стерильной средой. [c.79] Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора Микроманипулятор — прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку и суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. Микроманипулятор имеет два операционных штатива, между которыми расположен обычный микроскоп. На предметном столике микроскопа установлена влажная камера, в которую помещают препарат висячая капля . В держателях операционных штативов закреплены микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Микропипетки вводят во влажную камеру таким образом, чтобы их концы оказались в висячей капле. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой. [c.79] Перфильева можно использовать для выделения как крупных, так и мелких микроорганизмов. [c.80] Чистота выделенной культуры микроорганизмов должна быть тщательно проверена. Это осуществляется обычно несколькими способами визуальным, микроскопическим контролем и высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, культура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред. [c.80] Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (мкм=0,001 мм=10 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцентную. [c.81] Существуют различные модели учебных и исследовательских световых микроскопов. Внешний вид и принципиальное устройство одного из них (микроскоп биологический рабочий, МБР-1) приведены на рисунке 43. Подобные микроскопы позволяют определить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвижность, степень морфологической гетерогенности, а также характерную для микроорганизмов способность к дифференцирующему окрашиванию. Рассмотрим некоторые особенности оптической системы светового микроскопа на примере МБР-1, так как от знания их зависит успех наблюдения объекта и надежность получаемых результатов. [c.81] Оптическая часть микроскопа включает осветительный аппарат, объектив и окуляр. [c.81] Объектив представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Он дает действительное увеличенное и обратное изображение изучаемого объекта. Объектив состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Самая главная — наружная (фронтальная) линза, от фокусного расстояния которой зависит увеличение объектива. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Увеличение объектива всегда обозначено на его оправе. От увеличения объектива зависят еще две его характеристики — рабочее расстояние, т. е. расстояние от фронтальной линзы до плоскости препарата при сфокусированном объекте, и площадь поля зрения. Чем больше увеличение объектива, тем меньше его рабочее расстояние и поле зрения (табл.. 10). [c.83] Микроскопы имеют сухие объективы для наблюдения живых микроорганизмов, а также для поиска нужного поля зрения, дающие увеличение в 8 (10) и 40 раз, и иммерсионные, увеличивающие объект в 90 (100 раз) и позволяющие провести более детальное изучение формы и строения микроорганизмов. [c.83] Окуляр содержит две линзы — глазную (верхнюю) и собирательную и служит для рассмотрения изображения предмета, даваемого объективом, т. е. выполняют роль лупы. Окуляры могут давать увеличение в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз, что указано на их оправе, например 15Х- Общее увеличение окуляра повышается с уменьшением фокусного расстояния линз, его составляющих, поэтому более сильные окуляры будут короткими, а более слабые — длинными. [c.83] Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Так, например, использование окуляра 15Х и объектива 90Х позволяет увеличить объект в 1350 раз. Однако общее увеличение еще не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может оказаться как четким, так и нечетки.м. [c.83] Вернуться к основной статье