ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ из "Анализ генома" Все эксперименты по переносу генетического материала состоят из двух отдельных этапов переноса ДНК от донора к реципиенту и отбора реципиентных клеток, которые включили генетический материал донора. Большинство соответствующих методов позволяют ввести чужеродный материал в одну клетку из тысячи, а то и десяти миллионов (10- —10- ), поэтому для отбора нужны весьма эффективные средства. Именно эта стадия зачастую является лимитирующей в ходе эксперимента. [c.8] В данной главе мы опишем методы слияния клеток, MMGT, MGT и DMGT. В обзорах [19—24] можно найти описание их биологических основ, а также примеры применения. [c.10] Условия культивирования клеток должны обеспечивать их максимальную жизнеспособность. Это особенно важно для клеток, используемых в эксперименте по переносу, поскольку данная процедура предполагает использование потенциально токсичных веществ, таких, например, как полиэтиленгликоль (ПЭГ). [c.10] Успех экспериментов по генетическому переносу во многом определяется эффективностью посева клеток-реципиентов. Следовательно, эффективность посева всех клеточных линий, которые будут использованы в качестве реципиентов, должна быть проверена в условиях, аналогичных экспериментальным. Линии, демонстрирующие эффективность посева менее 10%, не годятся на роль реципиента. [c.10] Все манипуляции, описываемые в этой главе, необходимо проводить в стерильных условиях и со стерильными реагентами. Растворы следует готовить только из реактивов, предназначенных для культивирования клеток, обязательно использовать для этого бидистиллированную воду. Важно, чтобы читатель был хорошо знаком со стандартной техникой культивирования и клонирования клеток. [c.10] Подробное описание методов селекции выходит за рамки этой главы однако без достаточного представления о них попытки осуществить трансфекцию могут оказаться безуспешными. Цель селекции — предоставление определенных преимуществ клеткам, необходимым экспериментатору. Существуют четыре группы методов селекции. [c.11] Для приготовления среды HAT к 98 мл среды для роста клеток необходимо добавить по 1 мл раствора 1 и раствора 2. [c.11] Раствор 2 гипоксантин и тимидин. [c.11] Учитывая важность НАТ-селекции, мы предлагаем вниманию читателей руководство по приготовлению соответствующей среды (табл. 1). [c.12] Этот подход избавляет нас от необходимости выделять специфический мутант, поскольку он подразумевает использование бактериальных генов, которые дают селективные преимущества при их экспрессии в клетках млекопитающих [28]. Для этого конструируют плазмидные и ретровирусные векторы, в которых бактериальные гены сочетаются с промоторами, местами сплайсинга и сигналами полиаденилирования млекопитающих. Введение бактериальных генов в клетки млекопитающих с по--мощью трансфекции или инфекции приводит к их случайному распределению в геноме реципиента. В качестве примера бактериальных генов, способных обеспечивать селективные преимущества клеток млекопитающих, можно назвать ген Е. oli gpt (он позволяет клеткам-реципиентам утилизировать ксантин в качестве предшественника для биосинтеза пуринов) и генлео (он обусловливает устойчивость клеток млекопитающих к антибиотику G418) [29]. Основной недостаток этого метода — случайное распределение сайтов интеграции однако последние исследования позволяют надеяться, что с помощью гомологичной рекомбинации удастся осуществлять направленную интеграцию. [c.12] В роли селективного фактора могут выступать антитела. При этом мы получаем возможность выделять клетки с определенным набором антигенов клеточной поверхности [31]. Применение антител лежит в основе ряда методов, среди них отбор клеток с помощью клеточного сортера, розеткообразование с эритроцитами, связанными антителами, избирательное прикрепление клеток к поверхности с иммобилизованными на ней антителами. Хотя эффективность селекции клеток с помощью антител недостаточно высока (и более правильным было бы назвать этот метод обогащением), тем не менее селекция с использованием антител применяется во всех методах переноса генов, описываемых здесь, за исключением MMGT. [c.12] Мутировавшие протоонкогены, особенно члены семейства ras-генов, обеспечивают преимущества в росте клеток млекопитающих и, следовательно, могут быть использованы для селекции [22]. [c.13] Известно, что при смешивании клеток они могут спонтанно сливаться, однако событие это чрезвычайно редкое [1]. Эффективность слияния может быть существенно увеличена с помощью специфических антигенов. Первоначально для этой цели использовали инактивированный вирус Сендай [32], однако биологическая неоднородность различных партий инактивированного вируса и громоздкость процедуры слияния, индуцированного вирусом, привели к широкому использованию химического индуктора —полиэтиленгликоля (ПЭГ) [33]. Метод, представленный ниже, пригоден для слияния клеток как одного, так и разных видов животных. Внутривидовые гибриды формируются с частотой 10- —10- . Частота слияния клеток разных видов варьирует от 10 до 10 Клетки, имеющие сходные фенотипы и близкие параметры роста, сливаются с более высокой частотой. [c.13] Если это изменение в методике не повышает выход гибридных клеток, более успешной может оказаться альтернативная методика слияния, пригодная для растущих на подложке прикрепленных клеток (табл. 3). [c.15] Градиентные растворы хранят при 4 °С для их приготовления используют растворы перечисленные в табл. 4. [c.17] Продолжительная обработка клеток колцемидом с последующим воздействием цитохалазином В — один из наиболее простых способов индуцировать микронуклеацию [20]. Однако для каждого случая необходимо подобрать концентрацию реагентов и время экспозиции. Если этот метод окажется неудовлетворительным, можно воспользоваться двумя другими вариантами. Один из них — создание промежуточной донорной клетки. Недавно нам удалось получить гибридные соматические клетки человек—грызун и использовать их в качестве донора человеческих хромосом [37]. Гибридные клетки формируют мини-клетки в тех же условиях, что и используемые в качестве родительских клетки грызуна. [c.21] Вернуться к основной статье