ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Денатурация белков из "Химия и биология белков" Необратимое свертывание белка яиц при нагревании — явление хорошо известное. Подобное изменение в состоянии указанного белка может быть вызвано и действием ряда других физических и химических агентов сильным встряхиванием, облучением ультрафиолетовыми лучами, действием ультразвуковых волн, кислот, щелочей, органических растворителей, солей тяжелых металлов, мочевины, гуанидина, салицилатов и многих других веществ. При всех этих воздействиях белок теряет свою первоначальную растворимость и в большинстве случаев становится нерастворимым при изоэлектрической точке. В отличие от других белков коллаген при нагревании в воде растворяется. Измененные под влиянием всех указанных воздействий нативные белки получили название денатурированных белков. часто сопровождается потерей биологической активности белков. Так, например, ферменты теряют свою каталитическую активность, гормоны — физиологическую функцию, антитела — способность соединяться с антигеном. Эти изменения не всегда протекают параллельно изменениям физико-химических свойств белков. Денатурация, очевидно, представляет собой комплексное явление. Вряд ли можно думать, что действие столь различных соединений, как мочевина и серная кислота, а также влияние нагревания обусловливают одно и то же изменение белков. Нельзя поэтому просто говорить о денатурации белков, например яичного альбумина необходимо всегда указывать, какой именно агент вызвал денатурацию. [c.147] Дилатометрические определения показали, однако, что тепловая денатурация белков не сопровождается заметными изменениями в объеме [131, 132]. Гидратация денатурированных белков во влажном воздухе также оказалась лишь немногим меньше, чем гидратация нативных белков. Это означает, что денатурированные и нативные белки обладают примерно одинаковой способностью связывать воду [28, 133]. [c.148] ДО полного изменения в расположении пептидных цепей. Развертывание пептидных цепей при денатурации подтверждается тем, что денатурированные белки дают более интенсивные цветные реакции, чем нативные белки. Это было впервые установлено для реакций на сульфгидрильные группы цистеина и на дисульфидные группы цистина [136]. Реакция с нитропуссидом, титрование железосинеродистым калием [39], ацетилирование [137] и полярография [138] — все эти методы определения сульфгидрильных и дисульфидных групп показали, что число этих групп в денатурированных белках больше, чем в тех же белках, находящихся в нативном состоянии. Денатурированные белки дают также более интенсивные цветные реакции на тирозин с фосфорномолибденовой кислотой [139, 140] и с диазореактивом [141], а на аргинин с реактивом Сакагуши [142] и присоединяют большие количества иода [143]. В то время как в нативном лакто-глобулине только 12 -аминогрупп лизина реагируют с динитрофторбензолом, в денатурированном лактоглобулине эту реакцию дает 31 е-аминогруппа, т. е. все содержащиеся в нем е-аминогруппы [144]. Таким образом, все приведенные данные подтверждают ту точку зрения, что при денатурации в связи с развертыванием пептидных цепей становятся доступными те активные группы, которые в нативных белках недоступны для соответствующих реактивов. Подобным же образом можно объяснить меньшую устойчивость ряда денатурированных белков по отношению к действию трипсина. Как известно, многие денатурированные белки гораздо легче расщепляются трипсином, чем те же самые белки в нативном состоянии. Это можно рассматривать как следствие того, что при денатурации разрываются связи, тесно удерживающие пептидные цепи друг около друга, и обнажаются те пункты, на которые может воздействовать фермент [146, 147]. Можно полагать, что трипсин, гидролизуя (хотя и медленно) нативные белки, гидролизует, в сущности, содержащиеся в них следы денатурированных белков. При этом процессе должно происходить непрерывное нарушение равновесия в системе нативный белок—денатурированный белок и смещение этого равновесия в правую сторону. [c.149] Если денатурирование белка вызывается нагреванием, то белок остается в состоянии цвиттериона, разрыв же имевшихся солевых мостиков происходит вследствие обусловленного нагреванием усиленного движения пептидных цепей. Одновременно, однако, происходит образование новых межмолекулярных и внутримолекулярных мостиков, в результате чего белки свертываются. Развертывание пептидных цепей не может происходить, если вода не проникает в промежутки между пептидными цепями, поэтому сухие белки более устойчивы к нагреванию, чем их растворы. По этой же причине концентрированные растворы белков обладают более высокой устойчивостью по сравнению с разбавленными растворами. Кристаллы сывороточного альбумина сохраняют свою форму при нагревании [160]. [c.151] Сухие нативные белки денатурируются при сильном растирании их порошков [164]. В этих случаях денатурация, очевидно, обусловлена механической деформацией пептидных цепей или их разрывом. Большинство белков не денатурируется, если их растворы подвергать повторному замораживанию и оттаиванию [126]. Однако растворимость липопротеидов и биологические свойства некоторых антител меняются при таком воздействии [28]. Вопрос о денатурации при замораживании имеет очень большое значение при разрешении ряда проблем, касающихся технологии замораживания пищевых продуктов [165]. [c.152] Такое же окисление может иметь место и при действии на белки ультразвуковых волн. Эти волны могут влиять на белки тремя различными путями 1) действуя на механические колебания молекул 2) вызывая нагревание и 3) обусловливая выделение кислорода из воды [169]. При действии ультразвуковых волн кольца ароматических аминокислот разрушаются [169]. [c.152] Денатурация часто сопровождается очень резкими изменениями в растворимости белков. Если удалить денатурирующий агент, то при pH раствора, близком к изоэлектрической точке белка, белок свертывается. Выше уже указывалось, что свертывание белков может быть обусловлено образованием межмолекулярных солевых мостиков между ионными группами, располагающимися на поверхности белковой молекулы при развертывании пептидных цепей. Это предположение подтверждается тем, что щелочные протамины легко вступают в соединение с денату-рирова1И1ыми альбуминами, ею не реагируют с нативными [129]. [c.154] На фиг. 30 схема / изображает молекулу нативного белка, имеющую только внутримолекулярные солевые мостики, схема II представляет молекулы денатурированных белков, соединенные друг с другом мсжмолекулярными солевыми мостиками. На этих схемах образование структур, протекающее фактически в трех измерениях, представлено на плоскости, т. е. в двух измерениях. Гипотеза, приписывающая свертывание белков образованию солевых мостиков между ионными группами белков, принимается, однако, далеко не всеми исследователями. Некоторые из них считают, что нерастворимость денатурированных белков связана с пространственным перераспределением полярных и неполярных групп, которое выражается в переносе неполярных, гидрофобных групп на поверхность молекулы [134, 175, 176]. [c.155] Денатурация и свертывание некоторых белков могут быть предотвращены прибавлением концентрированных растворов глюкозы или других сахаров [177]. Свертывание сывороточного альбумина при нагревании тормозится также щелочными солями жирных кислот [178], кислыми красками, например конго красным [152], мочевиной и некоторыми другими соединениями. Действие всех этих веществ, возможно, обусловлено тем, что они адсорбируются на глобулярной молекуле белков, в связи с чем белок представляет собой центр большого растворимого комплекса. В некоторой степени денатурация белков может быть заторможена повышением вязкости растворителя, так как высокая вязкость замедляет движения пептидных цепей и затрудняет их развертывание. В этом же направлении действует и повышение давления [179]. [c.155] Скорость денатурации одних и тех же белков, выделенных из крови различных видов животных, может резко различаться. Это было показано на примере денатурации гемоглобинов разных видов животных едким натром. Так, например, гемоглобин человека денатурируется на 50% 0,05 н. раствором едкого натра в течение 20—30 сек., между тем денатурация на 50% гемоглобина быка происходит лишь в течение нескольких часов [180]. Интересно отметить, что скорость денатурации обоих гемоглобинов при нагревании или при действии соляной кислоты одинакова [181]. Эти данные могут быть объяснены тем, что разные денатурирующие агенты действуют на различные группировки белков, образуя отличающиеся друг от друга конечные продукты [182]. [c.155] Если сочетание пептидных цепей в нативном белке представляется менее стабильным, чем другие возможные сочетания, то денатурация будет необратимой и денатурированный белок будет сохранять то расположение пептидных цепей, которое возникло в связи с денатурацией. Поскольку каждый белок содержит сотни аминокислот, возможности для частичной денатурации и ренату-рации неисчислимы другими словами, сочетания пептидных цепей в денатурированном и в восстановленном белках представляют собой промежуточные варианты между сочетанием пептидных цепей в нативном белке и их сочетанием в различных белках, образующихся при более или менее полной денатурации. [c.157] Многие исследователи полагают, что денатурация подчиняется закону все или ничего , т. е. что денатурация всегда протекает полностью и никогда частично [190]. Это лшение трудно проверить экспериментально, поскольку лишь немногие свойства денатурированных белков поддаются количественному измерению. Нерастворимость денатурированного белка не может быть использована как критерий денатурации, так как коагулят нерастворимого денатурированного белка может адсорбировать молекулы нативного белка и, наоборот, само свертывание денатурированного белка может тормозиться благодаря защитному действию остающегося в растворе нативного белка. Поскольку мы не имеем в своем распоряжении достаточно надежных и доступных методов для решения вопроса о том, содержит ли денатурированный раствор белка частично денатурированные молекулы или же он содержит смесь нативных и полностью денатурированных молекул, весь вопрос остается открытым [130]. [c.157] Если теплоту, выделившуюся при первой реакции, обозначить через дЯд , а теплоту, выделившуюся при второй реакции — через АЯ ,, то разница — дЯ будет представлять теплоту денатурации. Эта величина для денатурации кристаллического пепсина равна +15 кал на 1 г азота, что соответствует +85 ООО кал на 1 моль пепсина, если принять молекулярный вес пепсина равным 35 ООО. При определениях теплоты денатурации метгемоглобина были получены величины того же порядка [192]. [c.158] Хорошо известно, что молекула каждого вещества находится в постоянном движении и что интенсивность этого движения зависит от температуры. При данной температуре Т энергия этого движения равна Т8. Если система содержит избыток энергии Р, то этот избыток может быть использован для производства работы. Р обозначает свободную энергию системы, которая может быть превращена в электрическую, механическую и другие формы энергии. Второй член в уравнении (1), Т8, обозначает ту энергию, которая не может быть использована для производства работы. Он отражает то минимальное количество энергии, которое необходимо для теплового движения молекул. Если механизм протекающей реакции таков, что интенсивность этого движения ослабляется, то энергия Т8 уменьшается на величину Тд5. Такое уменьшение энтропии происходит, например, в точке замерзания жидкости, когда жидкость переходит в твердое состояние. При обратном процессе, т. е. при переходе твердого кристаллического вещества в жидкое состояние при той же температуре, происходит потребление энергии. Так, например, требуется 79 кал для превращения льда в воду той же температуры. Поскольку величина свободной энергии Р одинакова для льда и воды при температуре 0°, вся потребляемая при указанном процессе энергия уходит на увеличение энтропии системы. [c.159] Если д/ и ДЯ известны, то Д5 может быть определена из уравнения (3). Полный термодинамический анализ обратимой денатурации кристаллического ингибитора трипсина показал, что дЯ равна +57 300 кал на 1 моль белка и что К я Р имеют значения, показанные в табл. 11. [c.160] Если сделать попытку истолковать приведенные выше результаты термодинамических анализов, пользуясь терминами молекулярной кинетики, то опять-таки процесс денатурации можно сравнить с таянием льда. При возрастании температуры перекрестные водородные мостики между пептидными цепями тают , вследствие чего ставите свободными пептидные цепи становятся более подвижными. [c.161] Для ингибитора трипсина были получены следующие величины Я1 = - -55 000 тл1моль, Яг = —1 900 кал]моль, 51 = = - -95 кал моль град, 5г = —84 кал моль град. Из отрицательного значения Яг ясно, что денатурация существенно отличается от реакции того типа, который изображен на фиг. 31, и соответствует типу реакции, схема которой приводится на фиг. 32 [196]. На этой схеме Я , и //д обозначают количества энергии в нативном, Фиг. 32. Термодинамические изменения активированном и дена-в процессе денатурации белков. турированном белках. [c.164] Отрицательное значение теплоты активации (Яг = — Яд ) термодинамически соответствует тому факту, что превращение денатурированного белка в нативный происходит скорее при низких температурах. Положительная величина 5] является мерой увеличения дезориентации, сопровождающей денатурацию. [c.164] Поскольку пептидные цепи в нативном белке строго ориентированы, а в денатурированном белке дезориентированы, энтропия денатурированных белков выше, чем энтропия нативных. Разница между величинами энтропии нативного и денатурированного белков получила название энтропии конфигурации [197]. При допущении некоторых упрощений она может быть выражена как отрицательный логарифм вероятности. Этим путем были получены величины от —4,3 до —6,1 единицы энтропии для каждого аминокислотного остатка белка, содержащего от 300 до 30 ООО аминокислот 10—20 различных типов. При этом расчете допускается, что число аминокислот каждого типа в белке одинаково. Если же принять, что число аминокислот различного типа в белке неодинаково, приведенные выше величины энтропии для каждой аминокислоты возрастут до —8 кал град. Для пепсина, молекулярный вес которого сравнительно невысок (35 000), такого рода вычисление дает величину, равную —5 кал1град на каждый аминокислотный остаток, а при Т = 300° — величину, равную 300(—5) =—1 500 кал на аминокислотный остаток [197]. дЯдля денатурации пепсина равна 85 ООО кал моль, или 300 кал для одного аминокислотного остатка. Из этого сопоставления очевидно, что ТЛ8 значительно больше, чем АН, и это означает, что денатурация сопровождается значительным увеличением энтропии. [c.165] Вернуться к основной статье