ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Молекулярные сита из "Хроматографические материалы" Сефадексы отмывают от необменно поглощенных липофильных веществ раствором детергента, спиртом или 1%-ным раствором щелочи (слабонабухаю-щие гели при этом можно нагреть до 60 °С). Хранить сефадексы лучше в сухом виде, промыв их спиртом и высушив под вакуумом при 60—80 °С. [c.55] Сефадексы — типичные мягкие гели. Они характеризуются большой проницаемостью, высокой эффективностью разделения и высокой емкостью. Фактор емкости VsIVm (отношение объемов растворителя внутри геля и вне его) равен 2—3. Недостаток — сильная сжимаемость, особенно у сильно набухающих сефадексов. Под давлением жидкости слой в колонке может деформироваться,. вследствие чего скорость фильтрации приходится существеино ограничивать. [c.56] Ири фракционировании веществ методом ШХ загрузка сефадекса раствором пробы достигает 1—4% от объема набивки в колонке. Элюирование всех компонентов смеси обычно заканчивается при прохождении через колонку объема элюента, равного полному объему набивки. Ожидаемое разбавление вещества в элюате — 5—20-кратное. ГПХ на сефадексах — исключительно мягкий метод разделения веществ, очень редко приводящий к денатурации лабильных соединений. Выход вещества, если нет специфической адсорбции, приближается к 100%. [c.56] Сефадексы очень часто применяют для обессоливания, т. е. группового фракционирования смеси, позволяющего отделить высокомолекулярное вещество от низкомолекулярных примесей. При обессоливании загрузка колонок раствором составляет обычно 10—25% (иногда до 30—40%) от объема набивки, независимо от концентрации вещества в растворе. Одно из важных преимуществ обессоливания на сефадексах и других подобных гелях — высокая скорость. Разбавление основного вещества в элюате можно свести к минимуму (до 1,25). [c.56] Сефадексы набухают и, следовательно, могут быть использованы в водных, водно-спиртовых растворах и некоторых органических растворителях диметил-сульфоксиде, формамиде (слабо набухающие гели— также в диметилформамиде). Специально для работы в полярных органических растворителях (см. разд. 39) предназначен липофильный сефадекс LH-20, который получают введением в матрицу оксипропиловых групп (производится с 1966 г.). [c.56] В настоящее время все сефадексы вырабатывают в микросферической, бисерной форме (раньше их выпускали в виде гранул произвольной ( юрмы). Рекомендуется применять грубые гели (100—300 мкм) для промышленных целей, концентрирования растворов высокомолекулярных веществ (с помощью сухих гелей) и быстрого обессоливания неустойчивых веществ средние (50—-150 мкм) — для препаративных целей, обессоливания и массовых анализов тонкие (20— 80 мкм) — для лабораторных исследований и сверхтонкие (10—40 mkai) — для ТСХ или для ГПХ с наивысшим разрешением. [c.57] Устойчивость геля к бактериальному действию намного выше, чем у исходного агара, но все же в состав элюентов желательно вводить антисептики 0,02% азида натрия, 0,5% бутанола, насыщенный раствор хлороформа. Для стерилизации гелей можно использовать 0,01%-ный раствор диэтилпирокарбоната. [c.57] Механическая прочность гранул удовлетворительная, но высушивание или замораживание не допускаются во избежание необратимых нарушений структуры. Гели можно использовать при температуре не ниже О—5 и не выше 25—40 °С. [c.57] Агарозные гели предназначены для ГПХ в водных растворах (см. разд. 28). Им присущи все достоинства и недостатки, свойственные мягким гелям. В зависимости от скорости фильтрации и концентрации элюента высота слоя в колонке может довольно сильно изменяться. Для улучшения воспроизводимости результатов рекомендуется механически фиксировать положение слоя в колонке при максимальной скорости фильтрации и применять элюенты с высокой концентрацией солей или спирта. [c.57] По сравнению с сильно набухающими сефадексами и полиакриламидными гелями агарозы обладают большей жесткостью и выдерживают более высокие давления. Уступая полиакриламидным гелям по разделительной способности, они в целом дают лучшие результаты, так как этот недостаток агароз можно компенсировать применением длинных колонок (за счет лучших фильтрационных свойств). Так как разные фирмы используют различные методы для выделения агарозы (отделения агаропектина от агара), продукты могут иметь различную чистоту и молекулярную массу. Эго отражается и на хроматографических характеристиках гранулированных агароз — их прочности, адсорбционной способности и т. п. В большинстве случаев гели производят в бисерной форме, но выпускают также гранульные гели с зернами произвольной формы. Поставляют гели в гидратированном состоянии, с раствором, содержащим антисептики, обычно — 0,02% азида натрия и 0,001 М ЭДТА (окончание на стр. 62). [c.57] П р и м е ч.а н и я. 1—12. Содержание ОН-групп 0,02 мг-экв/г. Рекомендуемое время полного набухания геля дано для комнатной температуры и, в скобках, для температуры кипящей водяной бани. 13. Липофильный гель получают алкилиро-ванием геля 3. Удельный объем в колонке указан для геля, набухшего в воде или метаноле в хлорО( рме, бутаноле, тетрагидрофуране удельный объем меньше 3,0—3,5 см /г. 14—23. Содержание ОН-групп не более 0,03—0,04 мг-экв/г. [c.59] Применение поперечносшитых агарозных гелей в общем аналогично применению таких же гелей с водородными мостиками (см. разд. 29). Преимущества сшитых гелей, наиболее полно выявляются при использовании их для получения биоспецифических сорбентов для аффинной хроматографии (см. носители Affi-Gel, разд. 120). [c.62] Полиакриламиды обладают высокой химической стабильностью. Они устойчивы к действию карбамида, гуанидина, органических кислот (уксусной, муравьиной), детергентов типа SDS. Рабочая область pH от 1—2 до 10—11, т. е. несколько шире, чем у сефадексов. В щелочных растворах ( 0,1 н.) амидные группы полимера подвержены гидролизу, что приводит к образованию карбоксильных групп и появлению катионообменных свойств (катионообменная емкость исходных гелей минимальна — не превышает 0,05 мкг-экв/г). Кислоты в концентрации выше 0,1 н. гидролизуют иминогруппы поперечных связей. Полиакриламиды неустойчивы к действию сильных окислителей. Гели выдерживают стерилизацию в автоклаве, но при температуре выше 120 С полимер разлагается. В рабочих условиях не рекомендуется использовать температуру выше 30—40 °С. Устойчивость полиакриламидов к бактериальному действию выше, чем у сефадексов, но все же недостаточна при хранении геля во влажном состоянии требуется добавлять антисептик, например 0,1% азида натрия. [c.63] Области применения полиакриламидных гелей те же, что и сефадексов (см. разд. 28). Для обессоливания наиболее пригодны гели марок от Р-2 до Р-10. Гель Р-2 успешно применяют для обессоливания пептидов и нуклеотидов. Сорбционные свойства полиакриламидов используют при разделении основных белков, нуклеотидов, нуклеозидов и нуклеиновых оснований методом адсорбцион ной хроматографии (В о п i 11 аС. А., Anal. Bio hem., 1969, v. 32, No. 3, p. 522— 529). [c.63] По классификации, принятой в ГПХ, полиакриламиды являются мягкими гелями, они не пригодны для работ при высоком давлении. Исключение составляет гель Р-2, который выдерживает давление до 4—7 кгс/см и поэтому его используют даже для ВСЖХ. Набухаемость П0лиакрила1у1идных гелей, по сравнению с сефадексами, меньше зависит от ионной силы растворов. [c.63] Вернуться к основной статье