ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Молекулярная гибридизация и амплификация нуклеиновых кислот из "Биологическая химия" Методы генной инженерии позволяют ввести ДНК-зонд в виде соответствующего двунитевого фрагмента в плазмиду. Эти плазмиды после размножения внутри бактериальных клеток можно использовать непосредственно в качестве зондов, так как, будучи расплавлены, такие плазмиды не полностью ренатурируют и содержат требуемые однонитевые фрагменты. Их также можно вырезать из плазмиды, используя специфические ферменты рестрикции (см. ,7.6), и пометить, используя различные химические и биохимические методы. [c.260] Как и в иммуноанализе, в гибридизационном анализе в настоящее время интенсивно развиваются подходы к нерадиохимической детекции, в первую очередь на основе использования ферментов. С этой целью можно либо использовать зонды, содержащие ковалентно присоединенный фермент, либо ввести в зонд какие-либо группы, способные взаимодействовать с вспомогательным белком, конъюгированным с ферментом. [c.261] Наряду с ферментами в гибридизационном анализе нередко применяют введение в зонд каких-либо гаптенов, например динитрофенильных остатков. В этом случае образовавшийся дуплекс можно зарегистрировать с помощью антител, специфичных к гаптену и конъюгированных с ферментом. [c.262] Наиболее простым способом гибридизации является проведение ее с образцом, нанесенным в виде пятна на некоторую подложку (дот-гибридизация, от англ. dot — пятно). Этот тип гибридизации фактически уже описывался на примере анализа на содержание гена энтеротоксина, Разрешающая сила метода повышается, если анализируемый образец предварительно подвергнуть гель-электрофорезу. В этом случае полезно перенести материал с геля на более удобный для проведения гибридизации материал, приведя гель в контакт с целлюлозным или нейлоновым фильтром. Добавление меченых зондов позволяет обнаружить полосы, несущие определяемые последовательности. Этот метод известен как гибридизация по ay зерну. [c.263] Следует отметать, что в случаях, не требующих сверхвысокой чувствительности, ПЦР может быть использована для того, чтобы определять наличие определенных нуклеотидных последовательностей в образце без последующей гибридизации. Появление полосы определенной длины в полиакриламидном геле при электрофорезе после того, как образец был подвергнут ПЦР с определенной парой праймеров, надежно указывает на то, что выбранная последовательность действительно присутствует в образце. [c.265] Значение ПЦР не ограничивается ее применением в гибридизационном анализе. ПЦР можно использовать и в препаративных целях для накопления достаточного количества материала ддя различных научных и прикладных задач, например для получения достаточного количества ДНК-зондов. [c.265] Вернуться к основной статье