ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Традиционные методы выделения и очистки биополимеров, используемые в физической и аналитической химии из "Биологическая химия" Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга. Наиболее производительные процедуры разделения основаны на различном распределении веществ между двумя фазами. Любая такая процедура приводит к разделению исходной смеси на две части (фракции), в одну из которых преимущественно или полностью переходит выделяемый компонент. Ввиду исключительной сложности смесей, с которыми имеют дело биохимики, на первых этапах разделения в подавляющем большинстве случаев фракция, содержащая выделяемое вещество, содержит множество других компонентов, т.е. происходит лишь частичная очистка (обогащение смеси искомым компонентом). [c.233] Выделение индивидуальных биополимеров является поэтому многоступенчатым процессом. На каждой ступени разделения должна получаться фракция, более богатая выделяемым веществом, чем на предыдущей ступени, и содержащая меньшее число побочных компонентов. Такой процесс часто называют фракционированием. [c.233] На каждой стадии разделения, включая и начальную, биополимер находится либо в виде раствора, либо в виде осадка. Говоря о разделении биополимеров, можно сразу же исключить из рассмотрения все методы, при которых одна из фаз, между которыми происходит распределение, является газовой. Биополимеры в ощутимых количествах в газовой фазе не существуют. [c.233] Для выделения искомого биополимера из раствора можно воспользоваться осаждением, для чего необходимо понизить растворимость этого биополимера. [c.233] Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспартата и глутамата, имеющими при нейтральном и щелочных значениях pH отрицательный заряд, и остатками лизина и аргинина, имеющими при слабоосновных и тем более при нейтральном и кислых pH положительный заряд. По мере повышения pH заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке (см. 3.1) оказывается равным нулю. Вблизи этой области белок оказывается лишенным ионной атмосферы и его молекулы могут беспрепятственно сближаться до радиуса действия ван-дер-ваальсова притяжения. В ряде случаев это приводит к выпадению белка в осадок. Такой способ выделения белков из раствора называют изоэлектрическим осаждением. [c.234] Выпавший осадок биополимера можно отделить от раствора фильтрованием. Известно, что фильтрование является высокопроизводительной операцией, применяющейся даже в промышленных масштабах. В то же время часто из-за мелкого размера выпавших частиц фильтрование проходит очень медленно, что затягивает процедуру выделения и может служить источником нежелательной инактивации биополимера. Поэтому в тех случаях, когда это не противопоказано масштабами разделения, в биохимии предпочитают использовать центр ифуги. Широко используются рефрижераторные центрифуги с охлаждением камеры, в которой вращается ротор. Частицы осажденного вещества под действием центробежного поля оседают на дне центрифужных стаканов и сжимаются в плотный осадок, с которого оставшийся раствор надосадочная жидкость, или супернатант) легко сливается или отсасывается. Скоростные центрифуги (ультрацентрифуги), создающие центробежное ускорение порядка 10 ускорений силы тяжести, т.е. порядка 10 м-с 2, позволяют осаждать даже некоторые достаточно крупные индивидуальные надмолекулярные агрегаты, такие, как рибосомы и вирусы. [c.234] Многие задачи по разделению веществ решаются с помощью сорбции части компонентов смеси на тех или иных сорбентах. В биохимии для этой цели часто используют гель фосфата кальция, известный также под названием гидроксиапа-тит. Для освобождения от низкомолекулярных соединений, содержащих ароматические кольца, применяют адсорбцию на активированном угле. Такие соединения взаимодействуют по механизму стекинга с полиароматической системой графита, составляющего основу активированного угля. [c.235] Заряженные компоненты можно сорбировать на ионитах — сорбентах, имеющих на поверхности заряженные группы. В исходном состоянии эти заряды в основном скомпенсированы какими-либо подвижными противоионами. Практически при сорбции на ионитах происходит обмен этих противоионов на сорбируемые одноименно заряженные компоненты разделяемой смеси, в связи с чем такую сорбцию часто называют ионообменной. Если на поверхности сорбента находятся отрицательно заряженные группы, то он связывает катионы и его называют катионитом. Сорбент, несущий положительно заряженные группы, называют антиони-том. [c.235] Все описанные выше методы грубого фракционирования, широко используемые на начальных этапах выделения биополимеров из биомассы, чаще всего не приводят к желаемому конечному результату, т.е. к получению индивидуального вещества. Последнее, как правило, достигается при использовании группы методов, которые можно квалифицировать как зональные методы разделения. Общая идеология этих методов состоит в том, что создается некоторая система, в которой компоненты смеси перемещаются с различными скоростями. Если в такую систему ввести разделяемую смесь в виде некоторой зоны, то по мере ее перемещения компоненты смеси, движущиеся в разными скоростями, будут формировать отдельные зовы, которые в конце процедуры разделения можно механически разнести в различные приемники, т.е. получить целую серию фракций. [c.237] Следует отметить, что скорость перемещения каждого компонента в опреде-лстной системе разделения и при заданных внешних условиях является его фи-зико-химической константой и может быть использована для идентификации вещества или регистрации его присутствия в некоторой системе. Поэтому зональные методы наряду с их огромным препаративным значением имеют и важное аналитическое применение. [c.237] Важнейшим зональным методом является хроматография. Как известно, хроматография бывает газовой, газожидкостной и жидкостной. По очевидным причинам при разделении биополимеров и их анализе используется только жидкостная хроматография. В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ в помощью тока элюирующей жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компонентам. При перемещении зоны с помощью тока элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе, причем тем большую, чем выше его сродство к этой фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона, содержащая выделяемое или анализируемое вещество, относительно неподвижной фазы. [c.237] В зависимости от природы физико-химического явления, лежащего в основе распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами, различают адсорбционную, ионообменную, распределительную и гель-хроматографию. Последнюю также называют эксклюзионной хроматографией. В адсорбционной хроматографии в качестве неподвижной фазы наиболее широко используют оксид алюминия. В ионообменной хроматографии используются те же типы ионитов, что и в ионообменной. сорбции. [c.237] Распределительная хроматография основала, на распределении веществ между двумя несмешивающимися жидкими фазами. При разделении биополимеров используют водно-органические фазы. Неподвижная жидкая фаза формируется в результате ее закрепления на пористом нерастворимом носителе силами полимо-лекулярной адсорбции. Если носитель по своей природе гидрофилен (целлюлоза, силикагель, стекло), то неподвижной является более гидрофильная жидкая фаза. Если же полимер, например силикагель, модифицирован объемистыми гидрофобными радикалами, то неподвижной является более гидрофобная фаза. В этом случае разделение называют хроматографией с обращенной фазой. [c.238] В гель-хроматографии используют те же типы материалов, что и в гель-фильт-рации, но подбирают гели с таким диапазоном размеров пор, чтобы часть из них была доступна для разделяемых компонентов. Вследствие неоднородности пор чем больше по размерам разделяемые молекулы, тем меньшее число пор доступно для этих молекул и соответственно тем меньшую долю времени они будут проводить в неподвижной фазе. Следовательно, зоны, отвечающие молекулам большего размера, будут перемещаться с более высокими скоростями. [c.238] В табл. 7,1 приведены сорбенты и носители, наиболее широко используемые в жидкостной хроматографии биополимеров. [c.238] Фирменные названия дау-эксы, амберлиты и др. [c.240] Электрофорез в растворе пока имеет весьма ограниченное применение, поскольку разделяемые по ходу электрофореза зоны, во-первых, подвергаются диффузионному размыванию, а во-вторых, что более существенно, размываются конвекционными токами, возникающими в результате незначительных неоднородностей температуры в системе, при ничтожных механических воздействиях и т.п. В настоящее время, по-видимому, начинается второе рождение этого метода в связи с возможностью проведения электрофореза в условиях невесомости на орбитальных космических станциях. [c.241] Гель возникает в результате образования водородных связей между цепями агарозы и в отличие от полиакриламида не содержит ковалентных межцепных сшивок. [c.242] Вернуться к основной статье