ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Конъюгация из "Молекулярная биотехнология принципы и применение" Рекомбинантная ДНК проникает в клетки бактерий, характеризующихся низкой частотой трансформации, таким же образом, как плазмидная ДНК из донорской клетки в реципиент-ную в естественных условиях. Некоторые плазмиды обладают способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и реципиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. Большинство плазмид, которые используются в работах с рекомбинантными ДНК, не обладают конъюгативными функциями и поэтому не могут переходить в реципиентные клетки путем конъюгации. Однако проникновение в клетку некоторых плазмидных векторов все-таки происходит при наличии в этой клетке второй плазмиды, обладающей конъюгативными свойствами. Таким образом, введя в клетку, несущую мобилизуемый плазмидный вектор, плазмиду с конъюгативными функциями, можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. [c.77] Поскольку для переноса плазмидной ДНК должна произойти-конъюгация между тремя бактериальными штаммами, эта процедура получила название тройного скрещивания. [c.77] Типичный эксперимент по клонированию генов включает следующие этапы. 1. Рестрик-тазное расщепление ДНК, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного), который может реплицироваться в клетке-хозяине, теми же рестриктазами, которые использовались для расщепления донорной ДНК. 3. Смещивание этих двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клеток-хозяев. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. [c.78] Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78] Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов X и Р1, а также плазмиды Р. [c.78] ДНК с помощью обратной транскриптазы эта цепь в свою очередь используется в качестве матрицы для синтеза второй цепи. После ферментативной обработки эту двухцепочечную комплементарную ДНК встраивают в вектор. [c.78] Независимо от того, какая именно стратегия клонирования используется, после идентификации клонированной последовательности необходимо показать, что она представляет собой нативный структурный ген. [c.78] Вернуться к основной статье