ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Электрофоретическое разделение полисахаридов из "Химия гемицеллюлоз" Кислые полисахариды, содержащие карбоксильные группы, при определенных значениях pH могут давать отрицательно заряженные полианионы, способные передвигаться к аноду под действием приложенной к электродам разности потенциалов. Скорость движения полианионов к электроду зависит от заряда молекулы, ее формы и молекулярного веса, что позволяет разделять различные по составу и молекулярному весу полисахариды. Особенно часто метод электрофореза применяется для установления однородности полисахаридов. [c.48] Нейтральные полисахариды также могут быть разделены электрофорезом в щелочном [32] или боратном буферных растворах. [c.48] При высоких значениях pH гидроксильная группа может быть ионизирована в виде несущего заряд полианиона. В боратных буферных растворах полисахариды образуют отрицательно заряженный комплекс, который, как правило, должен двигаться к аноду. Однако при электрофорезе на твердых носителях (бумага, волокно, стеклянный порошок) при pH 9,3 возможно перемещение боратных комплексов к катоду. [c.48] Электрофоретическое разделение полисахаридов может быть осуществлено различными путями под действием электрического тока в растворе (электрофорез с подвижной границей в ячейке Ти-зелиуса) на полосках бумаги, на листах бумаги из стеклянного волокна, на лентах из чистого отбеленного шелка, на колонках, заполненных стеклянным порошком (зонный электрофорез). [c.48] Электрофоретическое разделение в ячейке Тизелиуса применяется для определения гомогенности полисахаридов и определения числа компонентов в смесях полисахаридов. [c.48] В основу этого метода положено наблюдение за подвижной границей [33]. [c.48] Раствор полисахарида помещают в У-образную ячейку прибора для электрофореза, которая разделена плоскими шлифами на три секции таким образом, что ток жидкости через ее канал может быть прерван горизонтальным смещением центральной секции. При заполнении и монтировании ячейки раствор полисахарида помещают в нижнюю секцию. Одну часть центральной секции ячейки заполняют раствором полисахарида, а другую — буфером. Буфер помещают также в верхнюю секцию ячейки и в сосуды, соединенные с верхней секцией. При передвижении центральной секции в нормальное положение между раствором полисахарида и буфером образуется резкая граница. В ячейке поддерживают температуру 4 С, при которой плотность воды максимальная и конвекционные токи ничтожны. Смещение границы измеряют по фотографиям, сделанным через различные промежутки времени. Оптическое устройство работает по принципу регистрации изменения показателя преломления раствора в месте границы. [c.48] Перед зарядкой ячейки аппарата Тизелиуса приготовляют 2 %-ный раствор полисахарида в боратном буфере с pH 9,6 и днализуют его против примерно 400 мл буферного раствора в течение 16—24 ч. [c.48] Я — сопротивление буфера, ом т — коэффициент увеличения оптической системы. [c.49] Если при электрофоретическом разделении на диаграмме будет получен один пик, это еще не значит, что исследуемый полисахарид является однородным, так как несколько полисахаридов могут иметь одинаковую подвижность. Смена буфера помогает иногда выявить различия в полисахаридах. Вещество можно считать электрофоретически гомогенным, если для полисахарида наблюдается единственный пик в различных буферных растворах. [c.49] Гомогенность полисахарида проверяют обратным перемещением границы. Если пик соответствует одному полисахариду, изменение направления тока не вызывает обострения пика на диаграмме, если же пик образован смесью компонентов, изменение направления тока сделает пик на диаграмме более острым. [c.49] Второй метод электрофоретического разделения полисаридов основан на применении твердых носителей [34]. [c.49] На полосках твердого носителя размером 15X45 см вблизи анода отмечают карандашом стартовую линию, место нанесения исследуемого вещества и свидетели . В качестве свидетеля могут служить очищенные полисахариды, присутствующие в смеси, а также неподвижный свидетель , такой, как 2,3,6-три--О-метил-Ь Глюкоза, который не образует боратного комплекса с полисахаридами и не передвигается в электрическом поле, но будет указывать электро-эндоосмотический ток буфера по носителю в направлении катода. [c.49] Полоску твердого носителя опрыскивают боратным буфером (0,1 М раствором КагВ407 1ОН2О, pH 9,3) и помещают в прибор для электрофореза. Исследуемое вещество в виде раствора в воде, боратном буфере или щелочном растворе с pH 9,3 наносят из пипетки на полоску носителя так, чтобы 5—10 мал раствора, содержащего 10—50 мкг вещества, образовали на влажном носителе вдоль стартовой линии возможно более узкую полоску длиной не более 5 с/л. [c.49] Для количественных исследований в качестве носителя используют чистый отбеленный шелк (весом примерно 9 мг/см . Его тщательно промывают горячей водой с мылом, затем несколько раз водой и сушат. [c.49] Электрофорез ведут при напряжении 2000 в (при эффективной длине полоски около 40 см градиент напряжения составляет около 50 в/см) и силе тока 25 ма в течение 90 мин. Затем полоску вынимают, сушат на воздухе и разрезают вдоль на полоски шириной 5 см, соответствующие нанесенным углеводам, и каждую полоску на участки длиной 1 см. Участки нумеруют последовательно от анодного конца полоски к катодному. Из каждого участка вещество элюируют водой в тщательно вымытые пронумерованные градуированные пробирки и элюаты разбавляют водой до 1,5 мл. В каждую пробирку прибавляют по 3 мл сульфатированного а-нафтола (раствор 0,4 г а-нафтола в 100 мл концентрирован- ной серной кислоты выдерживают 8 ч при комнатной температуре). В процессе смешивания растворы охлаждают, а затем нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения определяют степень поглощения раствором Светового потока при 555 ммк. Затем строят график, отражающий изменение степени поглощения света в зависимости от расстояния от анода. Возникающие пики На графике указывают положение зон полисахаридов. [c.49] Подвижности измеряют, сравнивая расстояние между центром зоны полисахарида и зоны, двигавшейся параллельно 2,3,б-три-0-метил- )-глюкозы. Три-метилглюкозу можно обнаружить на шелке после опрыскивания 10%-ным раствором п-анизидина в смеси равных объемов влажного н-бутанола и уксусной кислоты и последующего 15-минутного нагревания при 100° С. Количество полисахарида можно вычислить, разделив общую величину поглощения света дайной зоной полисахарида на величину поглощения, соответствующую 1 мкг исследуемого полисахарида. [c.50] При качественных исследованиях успешно применяют стеклянную бумагу типа ватман ОР/А. В этом случае электрофорез проводят при 33 в/см и 140 ма в течение 45 мин. Для обнаружения полисахаридов применяют опрыскивание воздушносухой полоски с обеих сторон реагентом, содержащим 1 г и-анизи-днна и 2 мл концентрированной серной кислоты в 100 мл влажного н-бутанола и последующего 15-минутного нагревания при 100° С. Полисахариды после этой обработки образуют пурпурные зоны. [c.50] Для препаративного разделения полисаридов применяют колонки, наполненные стеклянным порошком, и буферный раствор 0,05 М раствор ЫагВЮт- ЮНгО). Электрофорез проводят при напряжении примерно 450 в (1,8 в/см) и силе тока 28—30 ма [34]. [c.50] Описано также электрофоретическое разделение полисахаридов в щелочном буфере [35]. [c.50] Вернуться к основной статье